中药木鳖子促进乳腺癌细胞ZR-75-30自噬研究

高荣，李子晗，马锦荣，何涛，方怡，郑蕾

（西安医学院药学院，陕西西安 710021）

癌症是严重威胁人类生命的疾病，从天然药物中筛选具有抗癌活性成分受到国内学者的关注。目前，抗癌中药及其制剂的开发已成为我国抗癌药物研究的重要方向[1]。

木鳖子 [学名:Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng.]为葫芦科苦瓜属植物木鳖的干燥成熟种子[2-3]，具有攻毒散积、疏结消散之功。已经报道的木鳖子中含有甾体类、三萜及其苷类、烯烃类、氨基酸类和有机酸等，可用于抗癌、抗菌、抗过敏、镇痛的治疗。木鳖子曾作为抗癌中药制剂枫苓合剂的君药，经药效学试验有显著的抗癌作用，并且在治疗肝癌、胃癌的临床试验中疗效良好[4-6]。

细胞自噬是存在于真核细胞内的一种依赖溶酶体的细胞死亡途径，胞内损伤的蛋白质和细胞器通过自噬作用被降解，产生的氨基酸、脂肪酸等再被细胞重新利用。诱导自噬的发生，可以保持细胞稳态，清除肿瘤细胞内折叠异常的蛋白和功能异常的细胞器，从而降低肿瘤的发生率，然而当肿瘤形成，自噬可降解肿瘤细胞内变形的蛋白质和细胞器，为其生长提供营养及能量，促进肿瘤生长[7]。自噬的发生可分为四个阶段:分隔膜的形成、自噬体的形成、自噬体的运输融合和自噬溶酶体的裂解[8]。自噬的调控因素主要有Beclin1、LC3、mTOR等[9]。

因此，何种药物可以诱导肿瘤细胞自噬，成为当今肿瘤治疗的热门方向[10]。本次实验选择乳腺癌细胞ZR-75-30，探究中药木鳖子是否通过细胞自噬发挥其抗癌功效。

1 实验部分

1.1 细胞、试剂与仪器

人乳腺癌细胞系ZR-75-30，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

MTT（Sigma）、胎 牛 血 清（HyClone）、RPMI 1640培养基（HyClone）。

倒置显微镜（Nikon）、酶联免疫检测仪（Bio-Rad）。

1.2 实验方法

1.2.1 试药提取

称取木鳖子碾碎后原药材10 g，加入100 mL双蒸水，浸泡过夜，水浴回流提取两次，每次1.5 h，合并上清液，加入3%活性炭，80℃蒸煮脱色30 min，以8000 r/min离心 10 min，收上清液蒸发干燥，得到木鳖子水提取物（CMSWE），4℃保存。用时DMSO溶解为 0.1 g/mL，保存于 4℃冰箱。

1.2.2 MTT法

取处于指数生长期的ZR-75-30细胞消化稀释浓度4×104mL-1于96孔板，隔日加入不同浓度药液，48h后取出，加入MTT，4 h后加入150 μL DMSO使甲臜溶解，用酶标仪在490 nm处测定每孔吸光度（OD）。

1.2.3 集落形成实验

取处于指数生长期的ZR-75-30细胞消化稀释浓度1×103mL-1于6孔板，隔天加入不同浓度的药物。15天后每孔用甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，用PBS洗两次进行拍照。

1.2.4 流式细胞术

取处于指数生长期的ZR-75-30细胞消化稀释浓度 3×105mL-1，加药后培养 48 h，消化细胞，放置染色1 h，滤网过滤，用流式细胞仪检测。

1.2.5 荧光染色技术

取处于指数生长期的ZR-75-30细胞消化稀释浓度2×104mL-1于6孔板，隔天加入不同浓度的药物。48 h后用单丹黄酰尸胺（MDC）染色，显微镜下观察。

1.2.6 Western杂交

取处于指数生长期的ZR-75-30细胞消化稀释浓度4×104mL-1于 6孔板，隔日加入不同浓度药液，48h后取出，收集并裂解，双缩脲法测定各样本蛋白浓度。按比例与上样缓冲液混匀，煮沸5min，得蛋白样本。10%丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，适当比例稀释的抗体孵育，显影，以GAPDH为内参，分析各蛋白条带光密度值。

2 结果与分析

2.1 木鳖子对ZR-75-30细胞生长的影响

由图1可得随着给药浓度的增大，细胞生长抑制率也逐渐增大。

图1 木鳖子对ZR-75-30细胞生长的影响

由图2可得，给药浓度A-C组逐渐增大，A组为空白组，由图可见，随给药浓度增大，细胞形成集落越弱。

图2 木鳖子对ZR-75-30细胞集落形成的影响

2.3 流式细胞术

由图3可以看出，被荧光染色的细胞占总收集细胞的比例由0.7%、8.0%、18.5%到22.6%逐渐增加，说明自噬情况逐渐加强。可得结论:中药木鳖子可以促进ZR-75-30细胞发生自噬，并且随给药浓度的增大，细胞发生自噬的能力逐渐增强。

图3 木鳖子对ZR-75-30细胞自噬作用的影响

2.4 MDC染色法

MDC染色部分表示了自噬小体，由图4看出绿色荧光逐渐增强，表示自噬小体的数目随给药浓度的增加而增多，说明木鳖子给药浓度越大，促进自噬能力越强。

图4 MDC荧光染色图

2.5 Western杂交

LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值大于1时存在自噬，由图5可见，空白组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值接近1，随给药浓度增大LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值逐渐增大，同时自噬正调控蛋白BECN1含量随给药浓度增大而增大。由此可得结论，中药木鳖子可以促进细胞自噬，且呈浓度依赖性，给药浓度越大，细胞发生自噬程度越大。

3 结论

本实验从细胞水平研究中药木鳖子促进乳腺癌ZR-75-30细胞自噬研究，通过MTT法、集落形成实验可确定中药木鳖子对人乳腺癌细胞ZR-75-30的生长具有明显的抑制作用。通过荧光染色（MDC）、流式细胞术和免疫印迹技术可以明确中药木鳖子促进细胞自噬的能力呈浓度依赖性。

综上，推测木鳖子可能通过自噬作用抑制乳腺癌的生长，我们将通过后续实验进一步研究木鳖子促进自噬的机制。