小鼠抗家兔胰岛细胞多克隆抗体的制备及鉴别

吴国娣，蒋煊，徐福远，吴岚岚，陈佳妮，傅红兴＊

（1.温州医科大学 药学院，浙江温州 325035；2.义乌市中医医院药剂科，浙江义乌 322000）

抗体（Antibody）是现代分子生物学的重要组成成分，在现代医学、分子生物学诊断等方面有广泛的应用。抗体通常是机体由于抗原的刺激而由效应B细胞分泌产生的具有保护作用的蛋白质，能识别特定外来物，即抗原[1]。多克隆抗体能识别任一抗原上的多个表位，允许抗原有微小的变化，且制备所需技术和技能不高，制备时间短，因此市场上品种很多[2]。本研究采用家兔胰岛细胞团为抗原，进行Balb/c小鼠接种，生产小鼠抗家兔胰岛细胞的特异性多克隆抗体，为该蛋白用于免疫组化法鉴定家兔胰岛和免疫磁珠分离胰岛等奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性新西兰大白兔，6～8周，体重为2.5～3.0 kg；雌性Balb/c小鼠，5～6周（温州医科大学实验动物中心提供）。

1.1.2 试剂和实验器材

Ⅴ型胶原酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma公司，美国）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL 1066培养液（温州怡康细胞移植技术开发有限公司）；胎牛血清（四季青公司）；牛血清白蛋白BSA（北京博尔西科技有限公司）；Hanks液（自配）；NIKON YS100显微镜（南京江南永新光学有限公司）；L-500台式低速多管架自动平衡离心机（上海利鑫坚离心机有限公司）；细胞培养箱（Thermo电子仪器有限公司）；scientz-IID超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 家兔胰岛的分离

结合文献报道[2-3]，家兔胰岛分离方法简述如下。选取新西兰大白兔一只，称重，耳缘静脉注射10%水合氯醛2.5～3.2 mL/kg麻醉后，腹部、颈部依次剃毛和消毒。沿腹白线打开腹腔，将肠管推向腹腔右侧，沿十二指肠下行至小肠部位，找到总胰管，用动脉夹夹闭总胰管至小肠入口，防止灌注胶原酶时将其灌入小肠；破心处死家兔，用留置针进行胰管插管和灌注0.8 mg/mL胶原酶Ⅴ约40 mL，待胰腺充分膨胀后，用眼科剪和镊子沿小肠壁、十二指肠壁和胃壁处快速完整剥离膨胀的胰腺组织。将其略剪碎后放置于含5 mL相同浓度胶原酶的2只50 mL离心管中，在（37.0±0.5）℃恒温水浴中上下柔和振摇消化，至胰腺组织消化至乳糜和泥沙状（3～4 min），分别加入35 mL的4℃ Hanks液终止消化。用Hanks液洗涤3次；往洗涤后的离心管分别加入10 mL Ficoll-1119，蜗旋混合后，再分别向两管依次贴壁缓慢加入5 mL Ficoll-1077 溶液和 5 mL Hanks溶液，离心机 2000 r/min离心5 min；吸取两管的上层清液倒至另两只新的50 mL离心管中洗涤胰岛组织3次，必要时将其带入细胞房进行进一步手工纯化。

将挑选所得的全部胰岛细胞团计数并快速转移至培养皿中，用CMRL 1066培养液（加胎牛血清和链霉素），在37℃的5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 小鼠免疫接种

将培养皿放入37℃恒温培养箱中培养1 h后，用移液枪将胰岛细胞团转移到2 mL的EP管中，1000 r/min离心 5 min，尽量弃去上层培养液，加入200 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，重复洗涤2次。在洗涤完的EP管中加入200 μL磷酸盐缓冲液，再加入等体积弗氏完全佐剂，用超声波细胞粉碎机进行乳化，将乳化好的抗原滴入冷水中进行检测，无油滴打散即符合要求。

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，小鼠做免疫接种前采集血样以作阴性对照，在小鼠腹股沟，颈部皮下，背部皮下分散4～6点注射，每点0.1 mL。每隔7天用磷酸盐缓冲液和弗氏不完全佐剂1∶1混匀乳化后加强免疫一次。

1.2.3 提取抗体

免疫5次后从小鼠尾静脉取1 mL血液，静置60 min后 10000 r/min离心 15 s分离得到小鼠血清，进行抗体检测。

1.2.4 抗体检测

采用家兔胰腺组织的免疫组化染色鉴别多克隆抗体。

1.2.4.1 HE染色

取新鲜家兔胰腺组织，用4%多聚甲醛固定24 h；常规进行脱甲醛、脱水、石蜡包埋、切片后，进行伊红和苏木精染色，用中性树脂封片，在显微镜下观察并拍照。

1.2.4.2 免疫组化染色

取新鲜家兔胰腺组织，用4%多聚甲醛固定24 h；常规脱甲醛、脱水、石蜡包埋、切片后， 用3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶、胰酶修复、BSA封闭抗原；将收集的小鼠抗家兔胰岛细胞血清用1%BSA稀释200倍，并覆盖在组织上4℃湿盒孵育过夜；再加入山羊抗小鼠IgG在37℃烘箱中孵育1 h，用1∶20DAB染液滴加至组织处，于镜下观察染色，用苏木素染核2～3 min，中性树脂封片；显微镜下观察并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 家兔胰岛分离结果

纯化后的家兔胰岛细胞形态圆整，大小不一，整体状态较好；培养后的胰岛细胞形态更圆整。一只家兔所能分离的胰岛细胞团个数在3700～4700个，与文献报道的一致[3-4]。

2.2 HE染色和免疫组化结果对比

取家兔胰腺组织进行HE染色和小鼠抗家兔胰岛细胞多克隆抗体的免疫组化研究，结果如图1所示。

图1 家兔胰腺组织的免疫组化（a）和HE染色（b）结果（×400）

由图1可知，该家兔胰腺组织在胰岛部位的染色呈阳性，免疫组化结果和HE染色结果一致性，而且外分泌腺组织不染色，说明采用本方法制备得到的小鼠抗家兔多克隆抗体有较好的特异性。

3 结论

胰岛细胞抗体（ICA）在糖尿病及胰岛功能相关免疫学研究中有很高的应用价值[5-6]。在本实验前期研究中，取家兔胰岛细胞对小鼠进行免疫接种，每隔7天免疫一次，在5周后通过免疫组化方法进行抗体鉴定时，发现使用不稀释的血清作为一抗进行免疫组化实验时，浓度过大，无法清晰、有效地进行染色，后来改用血清稀释200倍，染色效果最好。

总之，用家兔胰岛细胞多次免疫小鼠，使小鼠产生胰岛细胞抗体，同时通过免疫组化方法进行抗体的鉴定的方法是有效可行的。但更确信的结论还有赖于更多的试验探索。