田螺MT基因的克隆与鉴定

刘静，郭章，李景，沈宋利

（1.绍兴文理学院，浙江绍兴 312000；2.杭州伊美源检测科技有限公司，浙江杭州 310030；3.浙江鼎清环境检测技术有限公司，浙江杭州 310030；4.浙江聚光检测技术服务有限公司，浙江杭州 310053）

MT(金属硫蛋白基因，Metallothionein)是一种天然生物活性的物质，广泛存在于生物体内，能被金属离子、氧化损伤及免疫刺激等多种因素诱导产生，具有参与细胞内金属水平的稳态调节、清除重金属解毒自由基等重要生物学功能。

近年来，国内外学者对金属蛋白进行了广泛的研究，并已深入到基因水平。分子生物学技术的快速发展，使MT克隆技术、RNA印迹技术和PCR技术应用于MT的定量检测成为现实。MT克隆检测是通过MT多克隆和单克隆抗体，运用免疫扩散、免疫电泳等方法来对组织中的MT-mRNA含量进行定量分析，这在生物学研究中有重要的意义。然而目前还缺乏一种简便、灵敏、快捷适宜产业化的分离纯化和检测技术，这也成为MT研究的热点。

金属硫蛋白一个显著的特点就是能在转录水平上被环境中的金属所诱导，外界环境稳定时，MT在动物体内的表达是稳定的，当外界或者体内金属元素的含量超过一定浓度时，将诱导MT的表达，表达水平的高低与环境中的金属浓度有直接的关系[1]。目前普遍认为，金属硫蛋白主要的生理功能是稳态调节细胞内金属水平，即参与生物体内必需金属元素的调节和非必需金属元素的解毒[2]。

1 材料

1.1 实验动物

田螺，取自绍兴文理学院实验基地。

1.2 主要仪器设备

上海鼎科SW-CJ-1D垂直洁净工作台、美国赛洛捷克高速微量冷冻离心机D3024R、MASTER LOCK微型离心机Mini-6K、尚仪电热恒温鼓风干燥箱XGQ2000、icers药品冷藏箱、上海博讯立式自动电热压力蒸汽灭菌锅BXM-30R、常州国华数显恒温水浴箱HH-8、上海嘉鹏全自动凝胶成像分析系统ZF-288、驰唐暗箱紫外分析仪WFH-203C、Eppendorf基因扩增仪 Mastercycler X50、上海天能稳压稳流型电泳仪EPS200。

1.3 主要试剂及药品

无水乙醇，糖原，1.5 mL Eppendorf管（RNase-free），Tips（RNase-free）[α-32P]dCTP（＞ 400 Ci/mmol），50 mmol/L、200 mmol/L EDTA，TE- 饱和酚∶氯仿（1 ∶ 1），7.5 mol/L NH4Ac，100%、70% 乙醇，TE缓冲液、蛋白胨、NaCl、氯仿、琼脂、异戊醇等为国产分析纯；pMD19T载体、DNA Marker购自Takara公司；dNTPs、rizol试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA抽提试剂盒购自碧云天公司；DH5α、氨苄、X-Gal、青霉素、IPTG、EB等。

2 实验方法

2.1 准备工作

（1）塑料制品的处理。将DEPC加入装有离子水的玻璃烧杯中，制备为浓度0.1%的DEPC溶液。将待处理的塑料制品放入高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液至塑料制品全部浸泡。通风室温处理过夜。回收废液，用锡箔纸封口或包裹塑料制品，灭菌，烘干备用。

（2）玻璃和金属物品。用锡箔纸封口或包裹，250 ℃烘烤 3 h 以上。

（3）采取0.002 μmol/L氯化镧刺激田螺，取经镧刺激的鳃组织。

2.2 田螺RNA的提取

采用Trizol法提取田螺RNA。

（1）液氮研磨，将田螺鳃组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此3次，每50～100mg组织加入1ml Trizol，转入离心管进行第（2）步操作；

（2）匀浆:组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆需 1 ～ 2 min；

（3）细胞或组织加Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。可放入-70 ℃长期保存；

（4）12 000 g 离心 5 min，弃沉淀；

（5）根据 Trizol的体积，每 1 mL Trizol中加入200 μL氯仿，振荡混匀后室温放置15 min。注:禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂；

（6）4℃ 12 000 g 离心 15 min；

（7）吸取上层水相，至另一离心管中。弃下层酚相；

（8）按每1 mL Trizol中加入0.5 mL异丙醇混匀，室温放置 5～ 10 min；

（9）4℃ 12 000g离心 10 min，弃上清，RNA 沉于管底；

（10）按75%乙醇∶Trizol=1∶1比例加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

（11）4 ℃ 8 000 g 离心 5min，尽量弃上清；（12）室温晾干或真空干燥5～10 min；

（13）可 用 50 μL H2O、TE buffer或 0.5%SDS溶解 RNA样品，55～ 60 ℃，5～ 10 min。注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压；

（14）测O.D值定量RNA浓度。

2.3 MT基因克隆与鉴定

2.3.1 总RNA的检测

取3 μL的RNA样品和1 μL溴酚蓝Buffer混合，用1.0%普通琼脂糖凝胶电泳在100 V电压下电泳10 min，电泳结果用凝胶成像系统观察照相。

2.3.2 反转录

（1）灭菌离心管冰浴备用；

（2）将目的RNA和对照RNA冰浴融化；

（3）按顺序依次加入RNA 2.0 μL、引物dT17 1.0 μL、DEPC 水 2.0 μL；

（4）混匀后，分别将离心管于70 ℃水浴中保温5 min，再冰浴 5 min；

（5）在另一个离心管中依次加入DEPC 水 8.5 μL、5×RT Buffer 4.0 μL、dNTPs 1.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV RTase H 1.0 μL 试剂混匀并冰浴；

（6）将上述按每个反应15 μL准备的反应混合液，加入含5 μL先前配制的RNA模板和引物混合物的离心管中；

（7）模板和引物退火:将反应管置于25 ℃保温5 min；

（8）cDNA链合成:将反应管置于42 ℃保温1 h；（9）直接取用或冷冻保存。

2.3.3 PCR反应

将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR扩增反应，基因的特异性引物为MTf:5’-ATGGCATCTCAAGTGTGTGC-3’；MTr:5’-CTATCACTCGAGGTCAGTGT-3’。

PCR 结束后 4 ℃保存，再取出近 8 μL PCR 扩增液扩增产物用2.0%普通琼脂糖凝胶电泳在90 V电压下电泳10 min，EB溶液染色15～20 min，电泳结果用凝胶成像系统观察照相。

2.3.4 PCR产物的回收与克隆鉴定

（1）挑取大肠杆菌 DH5α 单菌落，接于 5 ml LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜；

（2）以1∶50比例将1 mL菌液转移到新鲜LB液体培养基中，37 ℃振荡培养1.5～2 h；

（3）将4 mL培养液转移到5 mL离心管中，4 ℃下，5000 rmp 离心 3 min；

（4）弃上清，加 0.5 mL 预冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，轻轻吹打或摇动以混匀细胞（勿剧烈振荡）；

（5）冰浴15～20min，4℃，5000 rmp离心2min；

（6）弃上清，加 0.1 mL 预冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞；

（7）取0.1 mL感受态细胞转移到1.5 mL离心管中，加 1 μL 质粒，混匀，冰上放置 30 min；

（8）42 ℃水浴 60 s，冰浴 2 min；加入 0.8 mL 新鲜 LB 培养基，37 ℃，180 r/min 振荡约 1 h；

（9）取200 μL涂布到含有氨苄青霉素的平板上，37 ℃倒置培养 12 h。

2.3.5 测序鉴定

挑取阳性克隆，扩大培养后测序。所得测序结果提交GenBank比对，辨别是否为所需的田螺MT基因片段。

3 结果与分析

3.1 田螺的RNA提取

总RNA提取如图1所示，说明RNA的完整性较好。

3.2 田螺MT的PCR扩增

对总RNA反转录所得到的cDNA进行PCR扩增，扩增出的条带在250 bp左右，即目的基因所在条带。结果见图2。

图2 MT的PCR扩增产物

3.3 MT基因的测序比对

经测序和提交Genbank比对，上述PCR扩增产物的序列均为MT序列，并且100%相同，表明分别从cDNA和DNA中扩增出了田螺的MT序列，两者序列完成一致，证明田螺MT基因不含有内含子，因此镧处理不影响MT基因的转录。

4 讨论

MT是一类富含半胱氨酸和金属离子的、具有基因多态性的小分子蛋白质，广泛表达于所有真核细胞和部分原核细胞的胞浆中。在应激等条件下，MT也可以被释放到细胞外来发挥作用[3]，具有广泛的生物学功能，是科技界在动物体内发现的一种生理功能很多的活性物质。，由于MT分子中含有20个游离的巯基（-SH）基因以及由它们组成的多个巯基簇，因此在提高生物体的健康生长、增强抵抗力、增强免疫力等方面具有十分重要的作用。金属硫蛋白具有很强的金属结合能力和氧化还原能力，在生物体内参与细胞内金属水平的稳态调节、自由基清除、重金属解毒等，具有重要的生物学功能[4].因此MT基因的结构及表达的调控是目前生物医学领域的一个研究热点。

MT具有很大的开发潜力和无法估量的应用价值，随着人们对MT研究的不断深入，对MT作用机理的不断探明，MT的应用也将越来越广泛。MT功能独特，近年来对MT的研究日益受到重视。不仅对MT的分子结构、性质、参与体内微量元素代谢、解除重金属的毒性、清除体内自由基、抗氧化损伤、防止机体衰老、应激能力等生物学功能进行了阐述，并对MT与肿瘤和其他疾病的关系等方面的研究进行了综述，并提出了MT研究中存在的问题及展望。MT作为模型系统，还可在基因工程和基因表达调控方面发挥巨大的效益，可从MT的代谢方面、生理机能上、结构上和在养殖业中的应用，挖掘出金属硫蛋白在养殖方向上的应用前景。