单因素考察甘草泻心汤超微饮片中甘草酸提取工艺研究

吴柱，谭军华，王灵芝，魏丹丹，3

（1.长沙医学院，湖南长沙 410219；2.湖南省九典制药股份有限公司，湖南长沙 410329；3.湖南易能生物医药有限公司，湖南长沙 410006）

甘草泻心汤出自《伤寒论》，处方组成为甘草四两（君）、黄芩三两、干姜三两（臣）、半夏半升、人参三两（佐）、黄连一两、大枣十二枚（使），主治伤寒，医反下之，并自利，心下痞硬，干呕，心烦不安。目前，甘草泻心汤临床应用广泛，在消化系统、肿瘤化疗后消化道、艾滋病难治性口腔溃疡、糖尿病、皮肤瘙痒症等治疗中效果突出[1-3]。方剂中甘草是君药，君甘草以保胃气，泻心，非泻结热，因胃虚不能调剂上下，致水寒上逆，火热不得下降，结为痞，甘草的主要有效成分为甘草酸。

目前对甘草泻心汤研究仅限于作用机制和临床疗效，关于甘草泻心汤超微饮片质量标准研究方面至今无相关报道。本论文旨在对甘草泻心汤超微饮片提取工艺进行研究，采用HPLC法测定甘草酸，为甘草泻心汤超微饮片的质量标准建立研究基础。

1 仪器与试药

1100高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）、AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）等。

甘草、黄芩、干姜、半夏、人参、黄连、大枣，购于湖南九芝堂零售有限公司捞刀河药店，于湖南中医药研究院分别超微粉碎；98%甘草酸标准品（上海西陇生化科技有限公司 ST0125），色谱甲醇（天津欧博凯化工有限公司，180810）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺研究

2.1.1 简单回流提取

将甘草泻心汤超微粉末精密称量12 g至圆底烧瓶中，加入一定量的溶剂（溶剂分别为乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇）浸泡静置30 mim，然后按照固液比1∶20[4]的比例加入溶剂共240 mL，回流提取3次，时间分别为 2 h、1.5 h、1 h，将提取液过滤，滤液浓缩成浸膏。

2.1.2 连续回流提取

将甘草泻心汤超微粉末按比例精密称取12 g至滤纸套内，加入一定量的溶剂（同2.1.1）至索氏提取器浸渍30 min，圆底烧瓶加入240 mL溶剂，回流提取4.5 h，过滤，滤液浓缩成浸膏。

2.1.3 超声提取

将甘草泻心汤超微粉末精密称量12 g至圆底烧瓶中，加入一定量溶剂（同2.1.1）浸泡静置30 min，

置于35 ℃的超声仪中超声（125 W，55kHz）2 h、1.5 h、1 h[5]，过滤，滤液浓缩成浸膏。

单因素考察不同提取溶剂和方法对甘草泻心汤超微粉末的影响结果见表1。

表1 三种不同提取溶剂及方法所得浸膏重

表1结果显示，以浸膏得率为评价指标，以95%乙醇为溶剂采用连续回流提取所得浸膏得率为37.52%，故此提取方法为最佳提取工艺。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制

取甘草酸对照品25 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇溶解，超声（300 W，40 kHz）30 min，放冷，定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液配制

将甘草泻心汤超微饮片精密称取12 g，按“2.1.2项”下提取，溶剂采用95%乙醇，滤液浓缩成浸膏。浸膏加 10 mL 甲醇溶解，精密量取 5 mL，至 25 mL 容量瓶中，加15 mL甲醇溶解，超声处理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性对照样品配制

将不含甘草的甘草泻心汤超微粉末按比例精密称量12g至滤纸套内，按照供试品溶液的制备方法制备即得。

2.3 色谱条件

色 谱 柱:Hyper ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相:甲醇 -0.2 mol/L乙酸铵 -冰醋酸（67 ∶33 ∶1）；柱温:30 ℃；流速:1 mL/min；波长:247 nm；进样量:20 μL。

取“2.2”项下供试品溶液、对照品溶液和阴性样品进样分析，结果见图1。

从图1中A与B可知，在此测定条件下，甘草酸的峰形稳定，保留时间为13.00min左右，图C可知，阴性对照样品无干扰。

2.4 线性关系的考察

分别配制甘草酸的对照品溶液（50、100、150、200 μg/mL 和 250 μg/mL)，按 2.3 项下色谱条件进样分析，以甘草酸浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积（A）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为 Y=17112X -234.69，R2= 0.999。结果表明:甘草酸对照品在50～250 μg/mL范围内线性关系良好。

图1 甘草泻心汤超微粉末中甘草酸HPLC图

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

精密吸取对照品溶液（150 μg/mL）20 μL注入色谱仪，重复进样6次，测定峰面积，RSD为0.86%，表明实验仪器的精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液，于室温放置，分别于 0、2、4、6、12 h和 24 h各进样 1次，每次20 μL，测定甘草酸峰面积，RSD为1.92%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重现性试验

精密称取同一批供试品溶液12 g，按2.2.2项下制备供试品溶液制备6份，按2.3项下条件分别进样20 μL，测定峰面积，RSD为1.98%，表明该法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品9份，分别精密加入高、中、低甘草酸对照品储备液，按2.2.2项下供试品溶液制备方法处理制成供试品溶液，依法进行含量测定，计算回收率，甘草酸的平均回收率为99.81%，RSD为1.95%，表明该方法的准确度良好。

2.6 验证试验

取3批10倍量甘草泻心汤超微粉末，按最优提取工艺进行3次验证试验，得三批超微粉末甘草酸含量为360.34、358.28、370.35μg/ml，RSD值为1.77%，说明该提取工艺稳定可靠。

3 结论

通过对甘草泻心汤超微饮片提取工艺的单因素进行考察，以得膏率为评价指标，以乙醇为提取溶剂的连续回流提取法（索式提取）所得粗提物量最多，且该方法不仅简单，易重复，而且具有明显的实用性，可作为甘草泻心汤超微饮片提取工艺。

本研究摸索甘草泻心汤超微饮片甘草酸含量测定色谱条件，通过全波长扫描确定在247 nm为检测波长，流动相以甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-冰醋酸（67∶33∶1）为流动相所得到的色谱图中，化合物的分离效果好，色谱峰形佳且相对稳定。

采用HPLC方法建立了甘草泻心汤超微饮片定量测定方法，所建立的色谱条件简单，适宜于经典名方甘草泻心汤甘草酸化合物含有量测定，有很好的实用性。

为传承发展中医药事业，经典名方的开发受到国家的重视，甘草泻心汤原方用作治疗狐惑病，随着医学的研究，其治疗范围渐渐拓宽，但对其质量标准的研究无相关报道，本研究所得结果为甘草泻心汤超微粉末的质量标准的建立提供一定的参考。