厌氧氨氧化颗粒污泥的扩培及菌种鉴定

□文/刘 鹏 张轶凡 孙晓莹 杨贝贝 聂英进

厌氧氨氧化（ANAMMOX）是指在厌氧或缺氧条件下，由一类浮霉菌门细菌以亚硝酸盐为电子受体，以铵盐为电子供体，反应生成氮气及少量硝酸盐的过程[1～3]。与传统生物脱氮工艺相比，厌氧氨氧化具有不需投加有机碳源、减少60%以上的曝气能耗、剩余污泥产量少等优点[4]。但是厌氧氨氧化菌生长速率仅为0.002 7 h-1，倍增时间长达10～12 d[5]对生长环境要求极其严苛，DO[6]、氨氮[7]、亚硝态氮[7]等因素均会影响菌的活性，制约了厌氧氨氧化技术在水处理中的应用；颗粒污泥具有生物组成多样、沉降性能良好、抗水质波动能力强等特点，培养出含厌氧氨氧化菌的颗粒污泥，将有利于后续工艺研究和工程应用，尤其是对氨氮含量高，仅靠传统生化处理难以实现达标排放的高浓度污水，如污泥厌氧消化后产生的厌氧消化沼液和垃圾转运、焚烧和填埋过程中产生的垃圾渗滤液等[8]的处理。有研究[9]采用UASB 反应器对厌氧氨氧化颗粒污泥进行培养，试验过程中发现得到的颗粒污泥密度低且容易流失；也有研究利用SBR反应器对厌氧氨氧化颗粒污泥进行培养，却发现该方法有总氮去除负荷低于2.0 kg/(m3·d)的缺点[10～11]。

综上所述，开发一种总氮去除负荷高、颗粒污泥生长稳定的扩培方法具有重要意义。

1 试验思路

以厌氧氨氧化颗粒污泥作为接种污泥，在发酵罐中以SBR 方式操作，由配水来提供主营养成分及微量元素；根据颗粒污泥的脱氮效能，随时调整进水中氨氮和亚硝态氮的浓度，逐渐提高体系的总氮负荷，使厌氧氨氧化颗粒污泥逐渐适应进水水质的变化，避免基质累积产生抑制作用；摸索出总氮去除负荷高，颗粒污泥增长稳定的扩培方法，为后续的工艺设计、中试及现场试验提供基础。通过对扩培后的颗粒污泥进行高通量测序，可以鉴定颗粒污泥中包含的菌种及其功能，确定厌氧氨氧化菌在颗粒污泥中所占的比例，证明该扩培方法的有效性。

2 材料与方法

2.1 接种污泥及配水组成

在天津某大学试验室内，从6 L容积的UASB反应器中取出2 L 厌氧氨氧化颗粒污泥为接种污泥，污泥浓度为20 000 mg/L，取出时总氮负荷为15 kg/(m3·d)；接种后，颗粒物泥浓度为800 mg/L，因此在扩培初期需要降低总氮负荷，在颗粒污泥驯化及增长的过程中，根据出水水质和总氮去除效率，逐步提高总氮负荷。

扩培过程所消耗的化学试剂分为主营养成分和微量元素两大类。其中，主营养成分选用的试剂为工业级，微量元素选择分析纯的试剂。除EDTA外，试剂中均不含有机成分，避免异养菌大量繁殖对厌氧氨氧化菌产生抑制作用，所有试剂均从天津阔希环保科技有限公司直接购买并按表1的浓度配制好后使用。

表1 主营养成分与微量元素浓缩液配方[12]

2.2 试验装置

扩培装置为上海百仑生物科技有限公司生产的HC014 不锈钢发酵罐。其有效容积为50 L，内径0.65 m，高径比2.63。见图1。

图1 厌氧氨氧化颗粒污泥扩培装置

以SBR的方式进行操作，每个换水周期为24 h，排水前需静置1 h，待颗粒污泥沉降后，排出上清液40 L，再进水到40 L 并加入微量元素浓缩液。将10 L 主营养成分母液用蠕动泵连续滴加23 h并不断搅拌。发酵罐需密封并且避光，防止溶氧和光照对颗粒污泥的生长产生抑制。罐体自带加热及保温装置，可将水的温度控制在（35±1）℃，pH控制在7.8～8.5，反应过程中需要观察pH的变化并补加稀硫酸，厌氧氨氧化产生的氮气接入到气体流量计中（型号为LMF-1，购自天津阔希环保科技有限公司）。由于颗粒污泥不断产生氮气，水中的溶解氧（DO）逐渐被排出，DO 值降低到0，发酵罐中可稳定维持厌氧环境。

2.3 测试项目与分析方法

氨氮（NH4+-N）采用纳氏试剂分光光度法测定，亚硝态氮（NO2—-N）采用 N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法测定，硝态氮（NO3—-N）采用酚二磺酸分光光度法测定，总氮（TN）采用过硫酸钾氧化分光光度法测定，混合液悬浮固体浓度（MLSS）采用重量法进行测定[13]。总氮负荷（NLR）、总氮去除负荷（NRR）及TN去除率由文献[14]中的公式计算得出。水的pH、温度和DO由发酵罐自带的电极进行测定。由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16 s RNA高通量测序，对厌氧氨氧化菌的含量进行测定并鉴定出颗粒污泥所包含的微生物。

3 结果与讨论

运输途中，厌氧氨氧化颗粒污泥的活性可能下降；因此，刚接种到发酵罐的颗粒污泥需要时间恢复活性并适应新环境。在扩培初期，先降低体系的总氮负荷，防止因厌氧氨氧化菌的活性下降导致进水中的基质累积，对菌的活性和生长产生抑制作用。由反应方程可知，厌氧氨氧化反应需保证进水中NO-2-N/NH+4-N的摩尔比在1.32∶1左右。

各测试项目随时间的变化情况见图2。

图2 各测试项随时间变化情况

启动阶段，NLR 由0.2 kg/（m3·d）逐渐提升到0.8 kg/（m3·d），此时进水NH+4-N、NO-2-N 的浓度分别为314、406 mg/L，NO-2-N/NH+4-N为1.29∶1；根据出水水质和TN 去除效率，判断颗粒污泥的活性，从而调整进水水质（NH+4-N和NO-2-N的浓度）；该阶段目的是使颗粒污泥恢复活性，适应扩培环境，共持续40 d左右；在启动阶段，NLR、NRR 和TN、NH+4-N 和NO-2-N 去除率，进出水水质均存在波动；NRR 与NLR 的变化趋势一致；当NLR提高速度快时，出水中NH+4-N和NO-2-N的浓度也升高，NO-3-N 出现累积，此时的TN 去除率明显降低，颗粒污泥的活性被抑制。需要及时排水，降低进水的NLR，让颗粒污泥恢复活性，适应水质变化后再逐渐提高NLR，可将TN去除率恢复到80%以上。

经过40 d 的启动及适应期后，颗粒污泥适应了环境，到扩培第80 d时，NLR已经提高到1.5 kg/(m3·d)，此时进水中NH+4-N、NO-2-N 的浓度分别为831、1 033 mg/L，NO-2-N/NH+4-N为1.24∶1；出水中NH+4-N、NO-2-N的浓度分别为 20、28 mg/L，NH+4-N 和NO-2-N 的去除率达90%以上；当出水中NO-3-N的浓度升高到254 mg/L时，NO-3-N/NH-N 为 0.30，接近 0.26 的理论值，TN 去除率仍达80%以上，证明颗粒污泥正在进行厌氧氨氧化且活性较高。第80 d 时，测得颗粒污泥的MLSS 为6 000 mg/L，与刚接种时MLSS为800 mg/L 相比，扩培效果明显。需额外注明的是，第45 d 时，图 2a、c、d 中出现的异常波动，是由pH控制误差导致，纠正后未再现。

到 106 d 时，NLR 已升高至 3.5 kg/(m3·d)，进水中NH+4-N、NO-2-N 的浓度分别为1 597、2 038 mg/L，NO-2-N/NH+4-N 为 1.28：1；出水中NH+4-N 浓度为 7.1 mg/L，NO-2-N 的浓度为 15.4 mg/L，NO-3-N 浓度为 429 mg/L，NO-3-N/NH-N为0.27。颗粒污泥正在进行厌氧氨氧化反应，TN 去除率在80%以上，NO-3-N 是由反应生成，没有抑制颗粒污泥的活性。体系的NRR 已经提高到3.38 kg/（m3·d），克服了采用SBR法扩培NRR难以达到2.0 kg/（m3·d）的缺点[10～11]。第106 d 时，测得颗粒污泥的 MLSS 为 11 300 mg/L，对比第 80 d 时的 6 000 mg/L，在26 d 内污泥浓度增加了5 300 mg/L。第100 d 时出现的NLR降低为停电导致的反应暂停，通电后扩培恢复正常。

从发酵罐中取出颗粒污泥进行观察，其为红色，颗粒直径在0.2～1 cm 之间，形状不规则。对颗粒污泥进行16 s RNA高通量测序，可以得到微生物的种类和含量，见图3。

其中：Candidatus Kuenenia 菌为目前已经发现的10 种 Anammox 菌之一[15]，属于浮霉菌门，是污水处理系统中常见的优势厌氧氨氧化菌，其比例占到了整个颗粒污泥微生物数量的11%；颗粒污泥中还有19%的反硝化菌（Denitrotisoma）[15]，它与厌氧氨氧化菌共生，可提高TN去除效果，减轻反应过程中NO-N的累积对厌氧氨氧化菌的抑制作用；1%的氨氧化菌（AOB，Nitrosomonas）[15]可将NH4+-N 氧化为NO-N，但由于扩培是在厌氧条件下运行，所以氨氧化菌含量很小，NO-2-N是由配水提供；亚硝态氮氧化菌（NOB，Nitrospira）[15]在颗粒污泥中没有检出，说明在厌氧环境下，出水中的NO-3-N是由厌氧氨氧化反应生成；异养菌（Chloroflexi，数量约占颗粒污泥的23%）可去除体系中的有机成分（如进水中的EDTA 以及厌氧氨氧化菌等产生的细胞分泌物和胞外聚合物），避免其他异养菌大量繁殖，同时也有助于颗粒污泥的成形[15]。

图3 厌氧氨氧化颗粒污泥的外观及菌种鉴定

4 结论

1）以厌氧氨氧化颗粒污泥为接种物，以SBR 的操作方式在50 L 发酵罐中进行扩培试验。通过监测进出水水质，根据TN去除效果调整进水中氨氮和亚硝态氮的浓度，可提高厌氧氨氧化颗粒污泥抗水质波动的能力，适应扩培体系并稳定生长。

2）在106 d 内，厌氧氨氧化颗粒污泥的浓度从接种时的800 mg/L 增长到11 300 mg/L，颗粒污泥呈现红色，大小在0.2～1 cm 之间，总氮去除负荷达到3.38 kg/(m3·d)，TN去除率稳定在80%以上。

3）通过16 sRNA高通量测序，Candidatus Kuenenia菌在颗粒污泥中的数量比为11%，该菌为常见的厌氧氨氧化优势菌之一。反硝化菌、异养菌和厌氧氨氧化菌共生，能够增强颗粒污泥抗硝态氮和有机成分累积的能力，提升TN去除效果。

文中所述方法能够稳定、高效的对厌氧氨氧化颗粒污泥进行扩培，克服了SBR反应器总氮去除负荷低的缺点，为厌氧氨氧化工艺开发和实际应用提供了基础。