半夏泻心汤对功能性消化不良大鼠胃肠动力及相关蛋白水平的影响*

刘 慧 朱延涛 王国军#

1 浙江中医药大学附属湖州中医院 浙江 湖州 313000 2 浙江省金华市中医医院 浙江 金华 321000

功能性消化不良（FD）是临床上最为常见的一种消化性疾病，研究表明，半夏泻心汤治疗FD效果良好。本研究通过观察半夏泻心汤对FD大鼠胃肠激素水平，胃排空、小肠推进监测，及胃窦组织C-kit、降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白表达水平，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物和饲料：选择体重约为（200±20）g成年SD大鼠60只，雌雄各半，SPF级，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，许可证：SYXK（浙）2016-0115。

1.2 主要试剂和设备：半夏泻心汤（半夏、大枣各12g，黄芩、人参、干姜、炙甘草各10g，黄连5g）由金华市中医医院药剂科提供，上述药物浸泡30min，煎煮2次，每次30min，纱布过滤，合并过滤液配制成1g/ml生药的水煎液；吗丁啉（多潘立酮片）：海南制药厂有限公司制药一厂，批号171101；硫酸阿托品注射液：天津药业集团新郑股份有限公司，批号：1706302；大鼠MOT、SP检测试剂盒：武汉酶免生物科技有限公司，批号MM-0491R1、MM-0495R3；酶 标 仪 ：ThermoScientific，型 号 ：CMax Plus；生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司，型号：LRH-150；荧光显微镜：Leica，型号：DM3000。

1.3 模型诱导：36只SD大鼠按体重随机分成6组，分别为：正常对照组、模型组、半夏泻心汤低、中、高剂量组、多潘立酮阳性组，每组6只。除正常对照组外，其余组按“不规则喂养法配合夹尾刺激法”造模14d，具体方法：正常饮水，单日喂食，双日禁食；用长海绵钳夹大鼠尾巴末端1/3处，以令其尖叫挣扎但不破皮为度，使它发怒并和其他大鼠厮打（若有抓伤，予碘伏消毒伤口，以防感染），每次刺激30min，每日刺激2次。

1.4 分组与给药：正常对照组和模型组灌胃生理盐水，半夏泻心汤低剂量组（1g/kg）、中剂量组（2g/kg）、高剂量组（4g/kg）分别灌胃相应的半夏泻心汤煎剂，阳性组灌胃多潘立酮（0.01g/kg），每日1次，连续14d。

1.5 一般情况观察：每天早晨9点观察记录各组大鼠状态：竖毛、拱背、激惹反应能力、排便、精神情况等。

1.6 血清胃动素（MOT）、P物质（SP）含量检测：末次给药后，各组大鼠禁食（12h）不禁水，采用心脏取血方式，3000r/min离心10min，转移上清液，采用酶联免疫法（Elisa）检测MOT、SP水平，具体操作严格按照Elisa试剂盒说明书进行。

1.7 胃排空和小肠推进率检测：实验第14d时禁食不禁水16h，末次给药20min后，正常对照组注射等溶剂的生理盐水，其余组均皮下注射硫酸阿托品注射液（2mg/kg）。20min后，灌胃半固体营养糊2g/只，20min后，脱颈椎处死，取出完整的胃，称量完整的胃重量，把胃打开，将胃内容物冲洗干净，再用滤纸将胃粘膜表层的水分吸掉，称量胃的净重，逐一记录并保留标本。胃排空率=[灌胃量-（胃重-胃净重）]/灌胃量×100%。将幽门至回盲部的小肠，平铺于玻璃板上，测量葡聚糖蓝2000在肠管内的移动距离和小肠全长。小肠推进率%=（葡聚糖蓝2000前端与幽门的距离/小肠全长）×100%。

1.8 胃窦组织中C-kit、CGRP蛋白表达及分布情况：各组大鼠解剖后用生理盐水清洗胃后迅速取1.0cm×1.0cm组织置于中性福尔马林缓冲液中固定24h，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，热修复抗原，双氧水室温避光下孵育10min，5% BSA 25℃封闭20min，1:100Ⅰ抗4℃过夜，生物素化Ⅱ抗37℃ 20min，SABC 37℃ 20min，DAB显色，苏木素复染1min，酒精脱水，二甲苯透明，中性胶封片，光学显微镜观察。标记细胞质可见棕黄色颗粒为c-kit、CGRP阳性，并计算阳性面积值。

1.9 统计学方法：采用SPSS19.0软件统计分析，计量资料以±s表示。计量资料若方差齐，则采用LSD检验两两比较；若方差不齐，其差异性则采用H-G检验，P＜0.05表示差异有显著性，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 半夏泻心汤对FD大鼠一般情况的影响：造模前，各组大鼠的一般状态比较稳定；造模后，与正常对照组相比，造模组大鼠毛发由顺泽逐渐转为凌乱干结，活动慢慢减少，出现倦怠、乏力，情绪变得易怒低落，大便逐渐变软、欠成形、甚至溏稀；各给药组FD大鼠精神状态均有一定程度的恢复。

2.2 半夏泻心汤对FD大鼠血清MOT、SP含量和胃排空率、小肠推进率的影响：见表1。

2.3 半夏泻心汤对FD大鼠胃窦组织C-kit和CGRP蛋白表达及分布的影响：光镜下可见各组大鼠胃窦组织均有C-kit和CGRP阳性表达。见表2和图1。

表1 半夏泻心汤对FD大鼠血清MOT、SP含量的影响（±s，n=6）

表1 半夏泻心汤对FD大鼠血清MOT、SP含量的影响（±s，n=6）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照组模型组多潘立酮组半夏泻心汤低剂量组半夏泻心汤中剂量组半夏泻心汤高剂量组小肠推进率66.16±1.94 43.60±8.51**60.37±6.19##55.72±6.55#57.29±9.52#67.61±4.28##SP（pg/ml）4.91±0.79 1.99±0.58**4.82±0.66##2.60±0.32#2.65±0.36#3.98±0.73##MOT（pg/ml）33.28±6.38 13.85±4.5**25.88±4.34##20.57±4.83#22.33±6.85#29.60±7.99##胃排空率70.69±9.89 48.55±7.51**64.33±9.52##61.63±7.21##64.00±6.79##70.48±6.21##

表2 半夏泻心汤对FD大鼠胃窦组织中C-kit和CGRP表达的影响（±s，n=3）

表2 半夏泻心汤对FD大鼠胃窦组织中C-kit和CGRP表达的影响（±s，n=3）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照组模型组多潘立酮组半夏泻心汤低剂量组半夏泻心汤中剂量组半夏泻心汤高剂量组IOD（CGRP）7819.1±1173.9 49252.9±14158.3**14782.7±2694.4##32120.2±6702.1#26701.2±2874.5##17322.6±1648.2##Area（C-kit）326914.7±34759.0 64048.7±7684.6**209944.2±28227.3##83375.0±15760.7#86696.2±14256.7#191709.2±23542.3##IOD（C-kit）68948.2±7637.4 10705.4±1988.1**42432.5±6019.7##14814.2±3495.4#15383.8±3055.1#38718.1±5193.7##Area（CGRP）48931.8±5986.3 251774.8±70628.9**81071.5±11641.6##166839.3±32694.6#140187.2±13826.3##91762.8±9009.8##

图1 半夏泻心汤对FD大鼠胃窦组织中C-kit（左图）和CGRP（右图）表达的影响（×200）

3 讨论

中医学将FD归于“痞满”“胃脘痛”等范畴，病位在胃，与肝脾密切相关，胃失和降，腑气不通，导致患者出现胃气上逆、脾胃运化、气机不畅，久则痰湿内停，痰阻气逆等一系列临床表现及体征。半夏泻心汤中，半夏辛温散痞，降逆止呕；黄芩、黄连苦寒泻热，干姜辛热散寒，降胃气之逆；党参、大枣健脾益气；炙甘草调和诸药。寒热并用以和阴阳，辛苦同施以调升降，补泻共进以理虚实，使脾胃气机升降归于正常，对FD患者具有良好的效果。胃肠激素对胃肠功能具有调节作用，在维持正常消化功能中发挥重要作用。MOT和SP是其中重要的两个指标，均能促进平滑肌收缩，加速胃排空。本实验发现，FD大鼠血清MOT、SP含量显著降低，胃排空率和小肠推进率降低明显。半夏泻心汤干预后，MOT、SP含量显著上调，且胃排空率和小肠推进率均明显提高，提示半夏泻心汤对功能性消化不良具有显著的干预和治疗作用。C-kit蛋白是一种特异性跨膜糖蛋白，研究发现其在调节胃肠道节律稳定性中发挥重要作用。此外，有报道FD患者胃粘膜CGRP浓度明显高于健康对照组[1]，提示CGRP可能与胃机械感觉过敏密切相关。本实验发现FD大鼠胃窦组织C-kit蛋白水平较正常组显著降低，CGRP蛋白水平增加。半夏泻心汤干预后，较模型组C-kit蛋白水平显著增加，CGRP蛋白明显降低，且有统计学差异。可见，半夏泻心汤能促进FD模型大鼠胃排空和小肠推进率，这可能与上调血清MOT、SP水平，上调胃窦组织C-kit蛋白水平，下调CGRP蛋白表达水平有关。