腺苷A2a受体激动剂(CGS21680)对幼龄大鼠体外循环肝脏损伤的保护作用

储培逸，葛建军，左 逸，孔 祥，赵智伟，周正春

现如今心脏手术的成功离不开体外循环技术(cardiopulmonary bypass,CPB)，该技术对改善患者预后有着十分重要的作用[1]。虽然现在越来越多的患者接受心脏手术，但是CPB这种技术由于其对患者全身是一种非常大的刺激，容易给患者带来多处组织损伤。之前的研究大多更关注心脏、肺及肾脏等器官，而对肝脏的关注不够，大约10%的心脏手术患者，往往存在着术后肝脏损伤。因此，寻找到一种可以减轻CPB对于肝脏所带来的损害是十分有必要的。

肝脏损伤的机制包含全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)与氧化应激反应。SIRS是由一系列复杂的炎症反应所引起的，如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和血小板的激活，以及细胞因子和白三烯的增加[2]。研究[3]表明，嘌呤核苷腺苷可以调节多种炎症反应。其中G蛋白偶联受体，包括A1、A2a、A2b和A3，可以显著地发挥腺苷的细胞活性[4-5]。正是由于A2a受体的存在，抗炎作用十分突出[6]。之前有研究[7]表明，腺苷A2a受体激动剂的激活可以减轻CPB后的肺损伤，但对减轻肝损伤的报道却极少。该研究通过构建幼龄大鼠的CPB模型，探讨腺苷A2a受体激动剂(CGS21680)是否可以减轻幼龄大鼠体外循环带来的肝损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料健康清洁级幼龄SD大鼠36只，5～6周龄，体质量(213±10.5)g，在相对清洁及恒温的环境下，予以标准饲料饲养。腺苷A2a受体激动剂CGS21680购自英国Tocris公司。

1.2 方法

1.2.1分组 将36只健康幼龄大鼠随机分为3组：假手术组、CPB组及CGS21680组，每组12只，幼龄大鼠术前12 h禁食及6 h禁水后，假手术组不进行CPB。CGS21680组在转流前往贮血器中加入CGS21680(120 μg/kg)。

1.2.2幼龄大鼠CPB模型的建立 本研究采用了Dong et al[8]开发的成年大鼠CPB模型，经腹腔内麻醉后气管切开插管接呼吸机。左侧股动脉穿刺24 G静脉留置针用于监测平均动脉压(MAP)及血气。经右侧颈静脉置入20 G多孔套管至右心房以引流静脉血入贮血器，再通过微量蠕动泵以及膜式肺氧合器，从右侧股动脉灌注。通过右侧颈静脉予以幼龄大鼠全身肝素化。CPB预充液采用的是含血预充，共20 ml。转流开始后约10 min流量逐渐加大到每分钟100 ml/kg，并维持此转速1 h后停机，严密观察幼龄大鼠的生命体征变化。

1.3 标本收集分别于肝素化后转流前(T0)、CPB 30 min(T1)、转流结束时(T2)和术后1 h(T3)从左股动脉采集血样，高速离心机5 000 r/min离心10 min后，取血浆保存于-80 ℃冰箱留待检测各项指标。术后1 h后处死幼龄大鼠，打开胸腔，分离肝脏并分成两部分，一部分于-80 ℃冰箱保存进行相关炎症因子等指标检测，剩余的肝脏切片后，用4%甲醛固定，光学显微镜观察形态学变化。

1.4 指标检测

1.4.1炎症因子的检测 ELISA法：用根据制造商的指导为幼龄大鼠制备的酶联免疫吸附测定试剂盒测定血液中白细胞介素-1β(interleukinin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukinin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等浓度，其中IL-1β浓度以ng/L表示，IL-6和TNF-α浓度则以μg/L表示。

1.4.2肝功能指标的检测 通过自动分析器(日本日立公司)检测幼龄大鼠的血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspertate transaminase，AST)水平，浓度均以U/L表示。

1.4.3抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)检测 根据试剂盒(南京建成生物制品)说明书指示测定GSH-PX活性，活性以酶活力单位U表示。

1.5 肝脏组织HE染色肝脏组织标本石蜡包埋后，用HE染色组织切片并在光学显微镜下观察，并由有经验且对实验不知情的病理学专家进行评估。

2 结果

2.1 各组幼龄大鼠术后一般情况36只幼龄大鼠均顺利建立CPB模型，术后1 h全部存活，酸碱度(potential of hydrogen，pH)、 MAP、红细胞比容(hematocrit value，HCT)、PO2、PCO2、iCa等数据在整个实验中的各个时间点都很稳定，所有数据符合临床且可被接受。见表1。

2.2 各组幼龄大鼠血清ALT、AST水平ALT及AST水平的变化在各组手术开始未发现差异，术中的时候，CPB组ALT及AST水平先降低后上升，而假手术组依旧保持低水平。而随着CGS21680组中的药物加入，虽然并不能改变ALT及AST的变化趋势，但是相比较于CPB组，AST及ALT的水平有明显降低(P<0.05)，见图1。

2.3 各组幼龄大鼠血清中炎症因子指标各时间点的变化各组幼龄大鼠血清中IL-1β及TNF-α的水平在T0时无明显差异，而随着手术的开始，T1～T3各时间点，CPB组中血清的炎症指标水平相比较于假手术组是显著上升的(P<0.05)，而CGS21680组中相对于CPB组的炎症指标却有显著下降(P<0.05)。见表2、3。

2.4 各组幼龄大鼠肝脏炎症因子指标的变化水平CPB组幼龄大鼠肝脏组织的炎症指标显著上升，IL-1β、IL-6和TNF-α显著高于假手术组(P<0.05)，而CGS21680组的各项炎症指标显著低于CPB组(P<0.05)。见表4。

2.5 各组幼龄大鼠血清中抗氧化指标的变化水平

表1 实验前后幼龄大鼠的基本情况

表2 各组幼龄大鼠血清中IL-1β表达水平

与CPB组比较：*P<0.05；与CGS21680组比较：#P<0.05; 与假手术组比较：▽P<0.05

表3 各组幼龄大鼠血清中TNF-α表达水平

与CPB组比较：*P<0.05；与CGS21680组比较：#P<0.05; 与假手术组比较：▽P<0.05

表4 各组幼龄大鼠肝脏中的炎症因子表达水平

与CGS21680组比较：*P<0.05；与假手术组比较：#P<0.05

图1 各组幼龄大鼠肝酶表达水平

如表5所示，各组幼龄大鼠血清中GSH-PX水平在T0时无明显差异，而T1～T3各时间点，CPB组与假手术组则有着显著差异(P<0.05)。在CGS21680组中，幼龄大鼠的GSH-PX水平显著高于CPB组(P<0.05)。

表5 各组幼龄大鼠血清中GSH-PX表达水平

与CPB组比较：*P<0.05；与假手术组比较：#P<0.05

2.6 各组幼龄大鼠肝组织HE染色情况假手术组肝索排列整齐，未见肿胀，而CPB组出现肝细胞溶解和坏死，组织紊乱，部分肝细胞水肿和少量胆红素积聚。CGS21680组肝细胞裂解和坏死要轻于CPB组，但仍存在少量的肝细胞水肿和组织间隙。见图2。

3 讨论

心脏外科的CPB手术对于人及动物来说，术后均会产生严重的创伤，目前研究普遍认为主要是系统性炎症反应综合征，极易产生炎症等反应，这些反应大多数来说都是由于手术本身创伤、转流过程中血液与管道接触、血液细胞的破坏以及全身多处脏器缺血再灌注损伤，而产生炎症因子进入循环中导致的。在过去的三十年中，很多研究关注CPB后患者的心脏、肺脏及肾脏等器官损伤及保护[9]。但现在越来越多的肝脏损伤对患者治愈率及死亡率的影响逐渐显现[10]，所以临床医师越来越多的关注术后肝脏损伤，寻找合适的药物来减轻CPB带来的巨大创伤一直是研究的方向。但出于伦理方面的考虑和其他影响因素，所以未能提供组织供以研究。因此，稳定的幼龄大鼠CPB模型是必需的。

图2 3组肝组织病理图 HE×200

本研究通过建立幼龄大鼠的CPB的模型，来观察和对比CPB组与假手术组的组织病理学及生化指标的变化，可以看出CPB后幼龄大鼠出现了肝脏损伤。而肝脏损伤会直接导致血清中的转氨酶上升，转氨酶的上升主要是指AST和ALT的上升，这可能是由于CPB的转流时间过长致使肝脏出现淤血，从而使细胞膜及线粒体受损而造成的变化。

通过检测炎症指标的变化可以看出CPB后，幼龄大鼠出现了肝脏损伤，且CPB组的幼龄大鼠的炎症指标水平明显高于假手术组，所以IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症指标的确起到了损伤肝脏的作用，这些作用可能是以补体和凝血系统的激活、内皮细胞功能障碍、血小板的活化及细胞因子产生等刺激方式触发的[11]。

据报道，腺苷具有显著的抗炎能力[12]。由于腺苷A2a受体亚型是炎症细胞中表达的主要腺苷受体，意味着腺苷的大部分抗炎作用可能依赖于A2a受体。而A2a受体也被认为存在于所有炎症细胞中，包括内皮细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞[13]。所以CGS21680可以显著减少CPB后幼龄大鼠体内的炎症指标水平，为了进一步探讨腺苷受体激动剂对幼龄大鼠肝脏保护的作用，CGS21680组中幼龄大鼠在接受CGS21680药物的干预后炎症因子的水平有着十分显著的下降，表明经过CPB后幼龄大鼠体内的大量炎症反应的减少可能的确是由于腺苷A2a受体激动剂CGS21680的存在，这些结果证明药物CGS21680可以通过抗炎作用来减轻幼龄大鼠CPB后所引起的肝脏损伤。

GSH-PX可以通过催化GSH成为氧化型谷胱甘肽(GSSG)参与抗氧化损伤的细胞防御。一些研究[14]表明，各种刺激引起的组织损伤与GSH消耗有关。上述结果发现CPB组中GSH-PX显著低于假手术组，而CGS21680组中GSH-PX相对于CPB组来说减少却并不明显。所以说GSH-PX参与了抗氧化防御。因此，结果表明腺苷受体的激活可以抑制氧化应激从而保护幼龄大鼠CPB所导致的肝脏损伤。

综上所述，腺苷受体激动剂CGS21680的确能够显著地减轻幼龄大鼠CPB所引起的肝脏损伤，这种结果可能主要是其抗炎与抗氧化应激作用所带来的[15]。因此，CGS21680药物可以被认为是保护肝脏损伤的潜在治疗药物，但该药物对于肝脏保护的具体机制及到临床使用等问题仍需进一步研究。