CP-25通过调控T细胞亚群治疗大鼠胶原性关节炎

汤小雨，王 琛，韩 乐，张贤政，疏金玲，蔡小雨，朱 悦，张玲玲，魏 伟

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、系统性、自身免疫性疾病，其主要病理表现在于关节滑膜炎。RA在全球都有分布，骨和软骨破坏是导致患者工作能力丧失和残疾的主要原因之一[1]。RA的主要病理特征包括滑膜细胞增生、内衬层的增厚、多种炎性细胞浸润，软骨和骨组织的破坏，并最终导致关节畸形和功能丧失。虽然有关细胞因子和其他炎症介质在RA发病中的作用做了大量研究，但RA的发病机制尚不明确[2]。异常活化的T细胞在RA病理机制中起关键作用，同时分化的T细胞亚群在RA中也存在失衡。其中，Th17细胞分泌高水平的IL-17，加速RA的发生发展[3]。胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)是一种免疫炎性动物模型，因为该模型有许多组织学和免疫学特征与RA相似，所以是筛选和研究治疗RA的药物的比较理想的动物模型[4]。

芍药苷-6-氧-苯磺酸(paeoniflorin-6'-O-benzenesulfonate, CP-25)是衍生的新型芍药苷活性单体。课题组前期研究[5-6]显示CP-25能够通过调节免疫应答而抑制大鼠佐剂性关节炎、小鼠CIA的继发炎症。艾拉莫德是具有免疫调节活性的环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)抑制药，临床用于治疗成人活动性RA[7]。艾拉莫德对大鼠CIA有明显的抗炎作用及关节滑膜保护作用，其机制可能与下调致炎因子白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平有关[8]。该研究拟在通过建立大鼠CIA模型的基础上，观察CP-25对大鼠CIA的治疗作用以及对活化T细胞亚群和分化T细胞亚群的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 40只雄性Wistar大鼠购于上海斯莱克公司，(150±20)g，42 d龄，合格证号：2015000532883。大鼠均在标准实验室条件下饲养。本研究所采用的实验方案均遵循实验室动物伦理准则，且经过安徽医科大学临床药理研究所动物实验伦理审查委员会批准。

1.1.2药物和试剂 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)通道小鼠抗-兔CD3、别藻青蛋白(allocyanin, APC)通道小鼠抗-兔CD4、藻红蛋白(phycoerythrin, PE)通道小鼠抗-兔 CD25、PE小鼠抗-兔 IFN-γ、PE 小鼠抗-兔 IL-4购自美国Becton, Dickinson(BD) 抗体公司；抗-小鼠/兔 IL-17A PE、FITC抗-小鼠/兔转录因子蛋白3(forkhead box protein 3, Foxp3)购自美国eBioscience公司；鸡II型胶原(CII)购自美国康德瑞公司；PBS：KCl 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 1.82 g和KH2PO40.2 g溶于双蒸水800 ml，将溶液的pH值调节至7.4，高压蒸汽灭菌，储存在4 ℃下以备使用；艾拉莫德(iguratimod)：江苏先声药业有限公司国家药品标准H20110084(25 mg，14粒/盒)；CP-25：由安徽医科大学临床药理研究所制药部门提供，白色粉末，纯度大于98%。

1.2 主要仪器AA-200DS电子天平购自美国Denver Instrument公司；Bio Tek Elx×808 酶标仪购自美国Bio Tek公司，BX-50型正置显微镜购自日本OLYMPUS公司；FC500流式细胞仪、FACScan仪器购自美国贝克曼库尔特公司；GL20A全自动高速冷冻离心机购自中国湖南仪器仪表总厂离心机厂；JA2003A型电子分析天平购自中国上海精天电子仪器厂；KDC-40超速离心机购自中国安徽科大创新中佳公司；Sim-F140制冰机购自日本SANYO公司；SW-CJ-1F型超净工作台购自江苏苏州苏净集团安泰公司，YLS-7B足趾容积测量仪购自中国山东医学科学院；高压蒸汽灭菌锅购自中国台湾STURDY公司。

1.3 实验方法

1.3.1大 鼠CIA模型的制备 在操作台中，将鸡Ⅱ型胶原溶于 0.05 mol/L的冰醋酸中，并在4 ℃下搅拌至完全溶解，终浓度为 4 mg/ml，置 4 ℃ 冰箱过夜，再将卡介苗(浓度为8 mg/ml)与其等体积混合使之充分乳化以制备鸡II型胶原乳液(所有操作都需要避光并且无菌)。第0天(第1次免疫日)于每只大鼠尾根部、足趾部多点(3～4点)皮内注射 0.2 ml CⅡ乳剂。第7天在尾根部、背部多点皮内注射0.1 ml的该乳剂作为加强[9]。

1.3.2实验分组和给药情况 Wistar系雄性大鼠按体质量随机分为4组：正常组、模型组、CP-25组和艾拉莫德组，每组10只。除正常组外，另外三组大鼠均制备CIA模型。大鼠建立CIA模型，第2次激发诱导后，当大鼠足爪出现红肿即开始给药。CP-25组大鼠每天1次灌胃给予CP-25，剂量为每只大鼠50 mg/kg，艾拉莫德组大鼠每天1次灌胃给予艾拉莫德，剂量为每只大鼠10 mg/kg，两种药均持续给药7周。正常组和模型组大鼠用相同体积生理盐水灌胃。

1.3.3足趾容积测量和关节炎足爪肿胀数评分 大鼠建立CIA模型后，每隔3 d对CIA大鼠进行1次足趾容积测量。炎症出现后，每隔3 d对CIA大鼠进行1次关节炎足爪肿胀数评分。按 0～4五级评分：每只足爪计1个踝关节和5个趾关节，每个关节肿胀为1分，每只鼠累计最多关节肿胀数24分。

1.3.4CIA大鼠脾脏的病理学观察 处死大鼠后，将脾脏无菌剥离并用HE染色。显微镜下观察不同组大鼠的组织病理学变化。根据动脉周围淋巴鞘的细胞密度，淋巴结节(淋巴滤泡)增生，红髓充血和生发中心的数量确定脾脏病理学，具体评分标准如表1所示[10]。

1.3.5CIA大鼠踝关节的病理学观察 先用10%甲醛溶液将大鼠踝关节固定后脱钙脱水，用石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察不同组大鼠踝关节的组织病理形态，根据滑膜细胞增殖、细胞侵蚀、血管翳形成、炎症和骨侵蚀的状况来确定脾脏病理学，具体评分标准如表2所示[11]。

1.3.6胸腺指数和脾指数的测定 第56天处死大鼠，在无菌环境中取脾脏和胸腺并分别称重。分别用每只大鼠“胸腺或脾脏的质量”比上相应“大鼠的质量”，即得到胸腺指数或脾脏指数。

1.3.7T、B淋巴细胞的分离 处死大鼠后，无菌剥离胸腺和脾脏。先常规制备胸腺细胞悬液和脾脏细胞悬液，再经大鼠淋巴细胞分离液纯化，从胸腺中分离出T淋巴细胞，从脾脏中分离出B淋巴细胞，调节细胞浓度至1×106个/ml。

1.3.8ConA诱导的胸腺T淋巴细胞增殖反应 将1.3.7得到的胸腺T细胞以每孔约1×105个细胞接种于96孔板中。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640，最终体积为200 μl，每个具有3个重复孔。加入ConA后置5%CO2培养箱中于37 ℃孵育48 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1～4 h，然后取出96孔板，将其置于酶-连接免疫吸附检测器，摇动15 s，然后在450 nm测量吸光度并对结果进行统计学分析。

表1 CIA大鼠脾脏病理的评分标准(n=10)

表2 CIA大鼠踝关节病理的评分标准

1.3.9LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖反应 将1.3.7得到的脾脏B细胞以每孔约1×105个细胞接种于96孔板中。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640，最终体积为200 μl，每个具有3个重复孔。加入LPS后置在5%CO2培养箱中于37 ℃孵育48 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1～4 h，然后取出96孔板，将其置于酶-连接免疫吸附检测器，摇动15 s，然后在450 nm测量吸光度并对结果进行统计学分析。

1.3.10流式细胞术检测大鼠外周血T细胞比例及脾脏T细胞亚群的表达 通过尾部血液取样获得大鼠外周血，并用红细胞裂解物分离淋巴细胞。根据说明书中推荐的浓度比，将CD3(FITC通道)、CD4(APC通道)和CD25(PE通道)的抗体组合分别添加到圆底管中。在室温下避光孵育后，洗涤细胞并通过流式细胞术分析。用FACScan仪器和相关的CellQuest软件分析细胞相关的荧光。第56天处死大鼠取脾脏，用红细胞裂解液分离脾脏淋巴细胞，然后将淋巴细胞悬浮液转移到圆底管中。将CD4(APC通道)、IL-17A(PE通道)、IFN-γ(PE通道)、IL-4(PE通道)的抗体组合按照说明书建议的浓度比例分别添加到圆底管中。① 细胞需要提前加4 μl细胞刺激剂，于5%CO2、37 ℃培养箱孵育6～8 h；② 6～8 h后取出细胞转移至微量离心管(EP管)中离心(2 500 r/min，10 min)后，弃上清液，用PBS洗涤1次，再离心；③ 在避光室温下添加表面抗体CD4(APC通道)孵育20 min；④ 每孔添加80 μl固定剂，振荡，在室温下避光孵育10 min，摇晃；⑤ 洗涤通过离心，每孔添加80 μl打孔剂，在室温下避光孵育8 min；加胞内抗体IL-17A(PE通道)避光孵育20 min(不可振荡)。在室温黑暗中孵育后，洗涤细胞并通过流式细胞术分析。Th1细胞、Th2细胞的检测同上。

2 结果

2.1 CIA大鼠的肿胀情况及药物的影响第1次造模作为第0天，7 d后加强给药，第12天大鼠足爪出现红肿，首先是原发侧红肿，以后延伸到继发侧、尾部、耳部。从第12天给予CP-25、艾拉莫德治疗。同时开始每周进行两次足趾容积测量、足爪肿胀数计数。肉眼观察显示，第21～31天为肿胀高峰期，第38天后肿胀逐渐减轻。CP-25、艾拉莫德明显降低CIA大鼠足爪肿胀(图1A)。与正常组比较，CIA模型组足趾容积、足爪肿胀数评分明显升高 (P<0.05)。与模型组比较，CP-25、艾拉莫德能够减轻大鼠CIA的足趾容积、足爪肿胀数(P<0.05)。模型组、CP-25组、艾拉莫德组足趾容积、足爪肿胀数评分在第21～31天达到高峰值随后逐渐下降(P<0.05)。其中CP-25组大鼠CIA的足爪肿胀数从第32天逐渐下降。艾拉莫德组大鼠足爪肿胀数从第30天逐渐下降(图 1B、1C)。

2.2 CIA大鼠脾脏病理变化情况及CP-25的影响将脾脏病理从以下四个方面进行分析：生发中心，淋巴鞘，淋巴滤泡，红髓。数据统计结果见表3。结果发现，与正常组比较，光镜下CIA模型组大鼠脾脏白髓淋巴组织明显增生，淋巴鞘细胞密度增加，生发中心出现(P<0.05)；与模型组比较，CP-25组白髓淋巴组织增生明显减轻，生发中心和淋巴滤泡增生明显减轻，淋巴鞘细胞密度增加也显著减弱(P<0.05)(图2)。

2.3 CIA大鼠踝关节病理学的检查通过以下四个方面对足关节病理进行分析：滑膜细胞增生，细胞侵蚀，血管翳，炎症，骨侵蚀。数据统计分析结果见表4。结果发现，与正常组比较，光镜下可见CIA模型组大鼠的滑膜组织中滑膜细胞增生明显，层次增多，排列紊乱，滑膜下层纤维组织增生，炎性细胞浸润及血管翳形成，软骨中炎性细胞浸润，软骨组织破坏(P<0.05)；与模型组比较，CP-25组和艾拉莫德组不同程度改善以上病理变化，滑膜细胞层未见明显增多，炎性细胞浸润减少；明显改善滑膜下层炎性细胞浸润和滑膜血管充血(P<0.05)(图3)。

2.4 CP-25降低CIA大鼠胸腺指数、脾脏指数及抑制T、B淋巴细胞增殖反应4组大鼠胸腺指数的测量结果见表5。与正常组比较，CIA模型组大鼠的胸腺指数明显升高(P<0.05)。与CIA模型组比较，CP-25组、艾拉莫德组明显降低胸腺指数和脾脏指数(P<0.05)(图 4A)。统计四组大鼠胸腺增殖指数和脾脏增殖指数的结果，见表6。与正常组比较，CIA模型组大鼠的T、B淋巴细胞增殖能力明显增加(P<0.05)。与CIA模型组比较，CP-25组、艾拉莫德组CIA大鼠的T、B淋巴细胞的增殖明显被抑制(P<0.05)(图 4B)。

图1 CP-25对CIA大鼠足爪肿胀的影响及对足趾容积、足爪肿胀数的影响

A：CP-25对CIA大鼠足爪肿胀的影响；a：正常组；b：模型组；c：CP-25组；d：艾拉莫德组；B：CP-25对CIA大鼠足趾容积的影响；C：CP-25对大鼠足爪肿胀数的影响；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；CP-25组与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；艾拉莫德组与模型组比较：▽P<0.05，▽▽P<0.01

图2 CP-25对大鼠脾脏病理变化的影响

A：各组大鼠脾脏的病理图×10；a：正常组：↑显示红髓，↓显示白髓；b：模型组：→出现生发中心，←显示淋巴滤泡增生；c：CP-25组；d：艾拉莫德组；B：CP-25对CIA大鼠脾脏病理的影响的统计分析；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 CP-25对大鼠踝关节病理变化的影响

A：各组大鼠踝关节的病理图×10；a：正常组：↓呈单层滑膜；b：模型组：↓显示炎性细胞浸润，←显示血管翳，→显示软骨破坏；c：CP-25组；d：艾拉莫德组；B：CP-25对CIA大鼠踝关节病理的影响的统计分析；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

表3 CP-25对CIA大鼠脾脏病理的影响

表4 CP-25对CIA大鼠踝关节病理的影响

表5 CP-25对CIA大鼠胸腺、脾脏指数的影响

表6 CP-25对CIA大鼠胸腺、脾脏增殖指数的影响

表7 CP-25对CIA大鼠外周血各细胞亚群变化的影响

图4 CP-25对大鼠胸腺、脾脏指数及T、B细胞增殖指数的影响

A： CP-25对大鼠胸腺、脾脏指数的影响；B：CP-25对大鼠胸腺T细胞、脾脏B细胞增殖指数的影响；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与正常组相比：#P<0.05，##P<0.01

图5 CP-25对CIA大鼠外周血各T细胞所占比例的影响及统计分析

A：CP-25对CIA大鼠外周血各细胞所占比例的影响的流式图；B：CP-25对CIA大鼠外周血各细胞所占比例的统计分析；与正常组比较：##P<0.01；与模型组比较：**P<0.01

2.5 CIA大鼠外周血活化T细胞亚群变化及CP-25对其影响将细胞流式术分析测得的CIA大鼠外周血中各细胞百分比的结果进行统计，见表7。与正常组比较， CIA模型组中大鼠外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD4+CD25+T细胞所占比例显著升高(P<0.05)；与模型组比较，CP-25组中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD4+CD25+T细胞的比例明显降低(P<0.05)(图 5)。

2.6 CIA大鼠脾脏分化T细胞亚群变化及CP-25对其影响通过统计流式细胞术检测各组大鼠脾脏分化T细胞亚群脾脏CD4+IFN-γ+Th1细胞，CD4+IL-4+Th2细胞，CD4+IL-17A+Th17细胞的百分比，见表8。结果发现，与正常组比较，CIA模型组中大鼠脾脏中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2的比例显著升高，CD4+IL-17A+Th17细胞的比例显著升高，P<0.05；与模型组比较，CP-25显著降低大鼠脾脏中CD4+IFN-γ+Th1细胞，CD4+IL-4+Th2细胞的表达比例，明显减少大鼠脾脏中CD4+IL-17A+Th17细胞的百分含量(P<0.05)(图6)。

表8 CP-25对CIA大鼠脾脏各细胞亚群变化的影响

图6 CP-25对CIA大鼠脾脏Th1、Th2、Th7细胞亚群变化的影响及统计分析

A:CP-25对CIA大鼠脾脏中各细胞在脾脏中百分含量的影响的流式图；B：CP-25对CIA大鼠脾脏中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2、CD4+IL-17A+Th17细胞在脾脏中百分含量的影响的统计分析；与正常组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

芍药是一种中药，具有抗炎、解痉和止痛作用。白芍(total glucosides of paeony, TGP)是从芍药的根部中提取，并批准了1998年芍药苷(Paeoniflorin, Pae)治疗RA。Pae是TGP的有效天然活性成分。TGP和Pae具有抗炎和免疫调节作用[12]。为了提高Pae的生物利用度，本实验室通过对Pae的化学结构进行修饰获得了CP-25[3]。

CIA模型的临床表现为多发性外周关节炎，病理变化主要是增殖性滑膜炎、关节软骨的破坏、骨侵蚀、在关节腔内有明显炎性细胞浸润等；有高浓度 IgG抗体自体II型胶原存在于动物体内[13]。由于其病理过程及实验室指标与RA相似，是筛选和研究治疗RA药物的较理想模型[14]。本研究中，肉眼观察到CP-25能够减轻CIA大鼠的肿胀情况，降低CIA大鼠的足趾容积、减少CIA大鼠的足爪肿胀数。光镜下观察到CP-25可以明显改善CIA大鼠脾脏病理情况，减轻白髓淋巴组织增生，减少生发中心个数和缓解滤泡增生，淋巴鞘细胞密度的增加也被显著减弱；CP-25可以不同程度改善CIA大鼠踝关节病理情况，CP-25组大鼠滑膜细胞层正常，细胞浸润减少，滑膜下层炎性细胞浸润和滑膜血管充血被明显改善。该研究结果提示CP-25对大鼠CIA继发炎症具有明显抗炎作用。

RA是一种自身免疫性疾病，T和B淋巴细胞的参与该病的发生和发展。效应T细胞可以分为Th1细胞(CD4+IFN-γ+)、Th2细胞(CD4+IL-4+)和Th17细胞(CD4+，IL-17A+)。其中，Th1细胞主要产生IFN-γ和IL-2，并在细胞免疫介导的炎症反应中起促进作用；Th2细胞主要生产IL-4、IL-5和IL-13，它可以促进B淋巴细胞的增殖和分化，并促进抗体产生和体液免疫；Th17细胞分泌的IL-17能够促进破骨细胞活化及基质金属蛋白酶的合成，诱导关节软骨降解[15]。因此T、B淋巴细胞间相互作用在RA的发病机制中有着非常重要的意义。本研究结果显示CP-25可以抑制CIA大鼠体内T、B淋巴细胞增殖反应，提示CP-25对CIA大鼠的治疗作用与T、B淋巴细胞有一定关系。CP-25可以降低CD4+IL-17A+Th17细胞的表达；CP-25可以降低CD4+IFN-γ+Th1细胞、CD4+IL-4+Th2细胞的表达。因此，CP-25可能通过影响效应T细胞(CD4+T细胞)之间的平衡来调控大鼠CIA的异常免疫应答和炎症反应。

综上所述，CP-25对大鼠CIA有明显治疗作用，可以有效缓解CIA大鼠的足趾容积增加、肿胀数增加，改善脾脏、踝关节病理变化，在CIA的发病过程中，CP-25具有良好的抗炎免疫软调节活性，可能通过多种途径调节CIA大鼠体内异常的免疫反应，这一研究提示CP-25在临床治疗RA有潜在前景。