外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗氧化胁迫及抗氧化系统的影响

蒋景龙，沈季雪,2，李 丽

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西汉中 723001；2.安徽省农业科学院茶叶研究所， 合肥 230001:；3.陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西汉中 723001)

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

选取籽粒饱满、大小均匀的‘春夏秋王’黄瓜种子，用50 ℃温水浸泡20 min，将其放置于蒸馏水中吸胀，6 h后于25 ℃恒温暗箱发芽，将发芽的种子播种于装有珍珠岩的塑料杯(65 mm× 45 mm×70 mm)中，每杯一粒种子，置于光照培养箱(PGX-1000B，上海乔枫实业有限公司)中培养，光照周期为12 h/12 h，温度为(25±1)℃，光强度为400 μmol·m-2·s-1，相对空气湿度60%。每天9:00每杯浇灌Hoagland营养液15 mL,待所有幼苗第1片真叶完全展开时，选取长势一致的幼苗进行试验处理。具体为：Hoagland营养液(CK)、Hoagland+200 mmol·L-1NaCl(T0)、Hoagland+200 mmol·L-1NaCl+1 μmol·L-1H2O2(T1)、Hoagland+200 mmol·L-1NaCl+5 μmol·L-1H2O2(T2)和Hoagland+200 mmol/L NaCl+10 μmol·L-1H2O2(T3)5种处理。处理6 d后取黄瓜幼苗为试验材料。每处理组至少设置3个生物学重复，每重复8～10株黄瓜幼苗。

1.2 生理生化指标测定

1.3 蛋白提取和SDS-PAGE电泳

黄瓜叶片和根总蛋白的提取参照Wu等[20]的三氯乙酸(TCA)-丙酮法提取，方法略有改进。取0.5 g叶片和根样品于液氮中研磨成粉，样品悬浮于1.5 mL预冷的TCA和w=0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液中，-20 ℃沉淀过夜，其间振荡数次。离心弃上清液，加入等体积含0.07%β-巯基乙醇的冰丙酮溶液，静置1 h，4 ℃、12 000×g离心，弃上清液；重复洗涤沉淀3～4次。直至上清液清亮，将沉淀真空干燥成粉末状。在蛋白干粉中加入600 μL裂解液(7 mol·L-1尿素、 2 mol·L-1硫脲、w=4% CHAPS、65 mmol·L-1DTT、40 mmol·L-1tris-base)充分涡旋混匀，冰浴超声促溶，4 ℃离心1 h。吸取上清液，分装至1.5 mL Eppendorf管内，液氮速冻后保存于 -80 ℃超低温冰箱。

蛋白质定量：选用BSA试剂盒法定量，分别吸取2 mg·mL-1的BSA样品溶液0、5、10、15、20、25 μL于6个Eppendorf离心管中，并用紫外分光光度计(UV1200型，美谱达仪器公司)测定480 nm处的吸光度，绘制以蛋白量(μg)为横坐标，吸光度(A480)为纵坐标的标准曲线。使用Microsoft Excel 2010对蛋白质样品吸光度与其量进行线性回归分析，得出样品蛋白的浓度，计算样品中蛋白质的量。

SDS-PAGE电泳：在1.5 mL的Ependorff离心管中加入1∶1的蛋白样液和电泳上样缓冲液，充分混合后沸水浴3 min使蛋白质变性，冷却后上样，上样量为10 μg。样品在浓缩胶中时电压设定为80 V，指示剂跑入分离胶后将电压调换为120 V，待指示剂跑至距离胶底部1 cm处切断电源，取出凝胶。取出凝胶后，在水中浸泡10 min左右，然后用固定液(25%异丙醇，10%乙酸)固定蛋白1 h。用考马斯亮蓝R250染液进行染色过夜，然后脱色液脱色，使条带清晰。将凝胶在水中浸泡10 min，取出后放入固定液固定1 h，之后在考马斯亮蓝R250染液中染色，过夜后取出加入脱色液脱色。对凝胶进行扫描后，Quantity One软件分析蛋白质差异条带。

1.4 MALDI-TOF/TOF-MS/MS蛋白鉴定与搜库分析

胶内酶解及Ziptip脱盐：每个胶粒切碎后放入Eppendorf管中，每管加入200～400 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3/30%ACN脱色，冻干后，加入5 μL 2.5～10 ng·μL-1测序级 Trypsin(Promega)溶液，37 ℃反应过夜，20 h左右；吸出酶解液，转移至新离心管中，向管中加入100 μL 60% ACN/0.1% TFA，超声15 min，合并前次溶液，冻干；若有盐，则用Ziptip(millipore)进行脱盐。

质谱分析：样品与5 mg·mL-1HCCA基质1∶1混合后，用4800串联飞行时间质谱仪〔4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)(Applied Biosystems，USA)进行质谱分析，激光源为355 nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为2 kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，PMF质量扫描范围为800～4 000 u，选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上选择8个母离子，二级MS/MS激光激发2 500次，碰撞能量2 kV，CID关闭。

数据库检索，使用以下数据库综合分析搜索：Database:NCBI；Taxonomy:Mycoplasma7442; Type of search:Peptide Mass Fingerprint(MS/MS Ion Search); Enzyme:Trypsin; Fixed modifications:Carbamidomethyl(C); Mass values:Monoisotopic; Protein Mass:UnrestrictedPeptide; Mass Tolerance:±100 ppm Fragment; Mass Tolerance:±0.4 Da; Peptide Charge State:1+；Max Missed Cleavages:1。鉴定成功标准：protein score c.i.%大于 90。蛋白得分则因蛋白长度和序列不同有一些区别，大约在50～55分以上。

1.5 数据处理

采用SPSS 16.0对试验数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗生长的 影响

形态观察发现，与CK组相比，T0组黄瓜幼苗普遍出现叶片萎蔫、植株倒伏和第2片真片叶生长抑制现象，外源H2O2处理明显缓解了NaCl对黄瓜幼苗的胁迫(图1)。NaCl胁迫处理后，黄瓜幼苗叶片大小、株高、根系长度和生物量等总体生长特性均受到显著影响(图2)。与CK组相比，T0组黄瓜叶面积、株高(地上部分)、根长、株鲜质量(地上部分)、株干质量(地上部分)、根鲜质量、根干质量和叶片RWC分别减少45.1%、 9.5%、29.9%、46.1%、35.5%、48.5%、55.3%和16.3%。梯度浓度的外源H2O2对黄瓜幼苗各生长参数均有显著改善，其中T2组增加最高，较T0组黄瓜幼苗叶面积、株高、根长、株鲜质量、株干质量、根鲜质量、根干质量和叶片RWC分别增加70.7%、6.1%、26.6%、37.4%、31.6%、 77.7%、90.1%和16.4%(图2)。

2.2 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗内和 H2O2质量摩尔浓度的影响

与CK组相比，T0组黄瓜幼苗叶片和根系H2O2质量摩尔浓度显著增加，与T0组相比，外源H2O2处理组叶片H2O2质量摩尔浓度均显著降低，T2和T3组根系H2O2质量摩尔浓度显著降低，T2组下降幅度最大，下降21. 6%。

图1 外源H2O2处理盐胁迫下黄瓜幼苗形态变化Fig.1 Morphological changes of cucumber seedlings treated with exogenous H2O2 under salt stress

每个值代表“平均值±标准差”。图中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Each value represents the “mean±standard deviation”. The different lowercase letters in the same figure indicates significant difference(P<0.05)

图2 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗生长指标的影响
Fig.2 Effects of exogenous H2O2treatments on growth indexes of cucumber seedlings under salt stress

2.3 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗细胞膜相对透性和脂质过氧化作用的影响

如图4所示，与CK组相比，T0组黄瓜幼苗叶片和根系REC显著增加，外源H2O2处理组叶片REC与T0组相比均显著降低，T2组根系REC与T0组相比显著降低，下降28.0%。

T0组黄瓜幼苗叶片和根系MDA质量摩尔浓度与CK组相比显著增加，分别增加86.7%和75.0%。T1和T2组叶片MDA质量摩尔浓度与T0组相比显著降低，外源H2O2处理组根系MDA质量摩尔浓度与T0组相比均显著降低。

2.4 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗抗氧化的影响

如表1所示，与CK组相比，T0组黄瓜幼苗叶片GSH质量分数显著降低，但根系GSH质量分数差异不显著。外源H2O2处理组叶片GSH质量分数较T0组均显著增加，均达到CK组水平，根系GSH质量分数较T0组和CK组均显著增加。与CK组相比，T0组黄瓜幼苗叶片和根系AsA质量摩尔浓度均显著降低，T2和T3组叶片AsA质量摩尔浓度较T0组均显著增加，均达到CK组水平，根系AsA质量摩尔浓度较T0组均显著增加。

与T0组相比，T2组根系SOD活性显著降低，其他组均无显著性差异。T0组叶片CAT活性较CK组显著降低，外源H2O2处理组的CAT活性较T0组均显著增加，达到CK组水平，而各组根系CAT活性差异不显著。与CK组相比，各处理组黄瓜幼苗叶片POD和GR活性显著增加，但各处理组间POD活性无显著差异，T0、T1和T3组间GR活性无显著差异，但T2组中GR活性无显著差异，但T2组中GR活性较T0、T1和T3组显著降低；同样，与对照组相比，各处理组 根系中POD和GR活性与叶片呈相反趋势，均显著降低。根中T1、T2组POD活性均显著高于T3。

图4 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜叶片和根系REC及MDA质量摩尔浓度的影响Fig.4 Effects of exogenous H2O2 on REC and molality of MDA in cucumber leaves and roots induced by salt stress

处理 TreatmentGSH/(μg·g-1)AsA/(μmol·g-1)SOD/(U·mg-1)CAT/(U·mg-1)POD/(U·mg-1)GR/(U·mg-1)叶片LeafCK12.49±1.34 a4.64±.011 a9.86±0.30 a5.42±0.21 a37.30±4.10 b24.12±6.96 cT09.42±2.36 b3.21±0.12 b10.54±0.09 a4.78±0.17 b45.30±1.45 a56.27±0.00 aT111.77±0.72 a3.71±0.54 b10.40±0.65 a5.20±0.20 a44.78±5.03 a52.25±4.02 aT212.97±0.57 a4.96±0.28 a10.46±0.34 a5.49±0.05 a45.78±2.52 a35.17±6.68 bT312.38±0.92 a5.30±0.23 a10.65±0.73 a5.23±0.14 a46.67±2.30 a48.23±0.00 a根系 Root systemCK9.29±0.00 c2.39±0.29 a3.62±0.19 ab2.04±0.15 a46.78±0.59 a32.15±8.04 aT09.08±1.31 c1.39±0.04 c4.08±0.45 a1.85±0.17 a42.78±2.82 b24.12±5.68 bT111.18±0.72 b1.66±0.12 b3.53±0.63 ab1.99±0.45 a50.03±2.33 a22.11±2.84 bT212.33±0.51 a2.20±0.09 a2.84±0.25 b1.65±0.14 a46.75±1.45 a24.12±6.96 bT313.54±0.55 a2.41±0.31 a3.28±0.86 ab2.01±0.31 a42.75±3.36 b26.08±4.02 b

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

2.5 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗蛋白表达的影响

采用SDS-PAGE提取和分离总蛋白，从图5可以看出，在盐胁迫下，外源H2O2处理导致黄瓜幼苗叶片和根系中蛋白质的表达发生变化。与CK组相比，1号蛋白条带在T0组稍有上调，仅在T2组表达明显下调，下调2.72倍，与T0组相比，T1和T3组表达上调，T3组上调幅度最大，上调2.26倍；2号蛋白条带在T0和T2组表达下调，而T1和T3组上调。3号蛋白条带在各组表达均上调，其中T0组上调幅度最大。4号蛋白条带表达量规律与3号条带相似，其中T1组上调幅度最大。

1,2 分别表示不同处理后黄瓜叶片的差异蛋白条带 1,2 respectively indicate the differential protein bands of cucumber leaves after different treatments; 3, 4分别表示不同处理后黄瓜根的差异蛋白条带 3 and 4 respectively indicate the differential protein bands of cucumber roots after different treatments

图5 外源H2O2对盐胁迫下黄瓜蛋白相对表达量的影响
Fig.5 Effects of exogenous H2O2on changes of relative expression ofprotein in cucumber leaves and roots induced by salt stress

对上述4个差异蛋白进行MALDI-TOF-MS分析与鉴定，4个蛋白条带均鉴定成功。经过鉴定，1号蛋白推测为甲基转移酶PMT5，2号蛋白可能为铁氧还蛋白依赖型谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT)，3号蛋白条带为网格蛋白重链1(CHC1)，4号蛋白条带检测结果为热休克蛋白70样蛋白15(表2)。

表2 差异蛋白质谱鉴定Table 2 Differentially expressed protein bands identified by MALDI-TOF/TOF-MS from SDS-PAGE gels

3 结论与讨论

通过SDS-PAGE比较不同处理下黄瓜幼苗叶片及根系蛋白表达的差异，根据MALDI-TOF-MS结果显示，推测1号蛋白为甲基转移酶PMT5，PMT5为Jak激酶结合蛋白(JBP1)，可与多种蛋白同时存在组成复合物。Zhang等[27]发现PRMT5的功能缺失会导致拟南芥对盐胁迫高度敏感，使其丧失协调盐胁迫耐受和生长发育的能力。在正常生长条件下，PRMT5结合在染色质上催化H4R3对称性双甲基化，从而抑制FLC和一系列胁迫响应基因的表达；当植物受到盐胁迫时，PRMT5从染色质上解离，导致H4R3对称性双甲基化水平降低以及FLC和胁迫响应基因的表达升高，从而促进植物在盐胁迫环境下正常的生长发育[28]。本研究中1号蛋白条带与对照组相比，盐胁迫后有轻微上调趋势，但不明显，而随着外源H2O2处理浓度的升高，则表现明显的上调-下调-上调的趋势，这表明外源H2O2处理可能引起甲基转移酶PMT5表达变化，而具体的原因尚不清楚，仍需要进一步深入研究。2号蛋白可能为铁氧还蛋白依赖型谷氨酸合成酶，在盐胁迫后明显下调，该结果与Popova等[29]研究盐土植物冰草经盐刺激后，铁氧还蛋白依赖型谷氨酸合成酶在叶片中的活性及转录水平降低相一致。而H2O2处理后则出现了上调-下调-上调的趋势，有趣的是1号蛋白和2号蛋白在H2O2处理时均表现出1 μmol·L-1和10 μmol·L-1处理引起蛋白的变化规律一致，而5 μmol·L-1处理则表现出不同的变化规律，这可能与信号分子H2O2的剂量效应有关。3号和4号蛋白分别为网格蛋白重链1(CHC1)和热休克蛋白70样蛋白15，这2个蛋白在盐胁迫后均表现出明显的上调，而与盐胁迫组相比，H2O2处理引起网格蛋白重链1(CHC1)下调趋势，而热休克蛋白70样蛋白15则表现出继续上调趋势。网格蛋白参与调控细胞抗逆反应，其介导的内吞是植物细胞膜蛋白内吞的主要途径，也是植物生长发育在逆境响应过程中呈现可塑性的重要机制之一[30]。热休克蛋白70(HSP70)是大多数生物体内含量最多的一类热休克蛋白，它的表达在细胞应激的情况下获得增强，参与各种机体细胞的保护，使植物对逆境胁迫的抵抗能力增加[31]。在盐胁迫下，H2O2处理引起了网格蛋白重链1(CHC1)的下调和热休克蛋白70样蛋白15上调，表明这2种蛋白可能参与H2O2处理介导缓解黄瓜盐胁迫响应，而表达的模式则相反，具体的机制仍需要进一步研究。本研究初步探讨了H2O2在黄瓜幼苗耐盐能力提高的生理及蛋白方面的影响，但是对于调控机理及基因表达机制等需要进一步研究。