靶向沉默TrkB基因对结肠癌细胞SW620失巢凋亡水平的影响

祁麟，齐春胜，肖波

失巢凋亡（anoikis）是细胞脱离基质或失去与其他细胞接触时启动的一种程序化细胞死亡形式，对于机体的正常发育至关重要[1-2]。但在肿瘤患者体内，部分肿瘤细胞获得了抵抗失巢凋亡的特性，能够从肿瘤原发灶部位脱离出来而不凋亡，从而进入循环系统发生转移[3]。神经营养因子酪氨酸激酶受体B（TrkB）是近年来新发现的一种特异性的失巢凋亡抑制因子[4]。大量研究显示，TrkB 在乳腺癌[5-7]、肝癌[8]、宫颈癌[9-10]、肺癌[11-12]、脑瘤[13]等多种肿瘤细胞中的表达显著上升，可导致肿瘤细胞获得失巢凋亡抵抗的特性，表现出较强的转移能力。目前，靶向肝、肺等器官的远端转移是结肠癌患者的主要致死因素之一，但TrkB在结肠癌细胞中的功能尚少见报道。本研究通过构建TrkB-shRNA 慢病毒干扰载体，在具有高转移潜能的结肠癌细胞SW620中靶向沉默TrkB基因的表达，探讨TrkB基因对结肠癌细胞失巢凋亡的影响以及对结肠癌细胞体内转移的作用机制，为进一步研究TrkB 为靶点的肿瘤治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人结肠癌细胞SW620 和人胚肾上皮细胞HEK-293T 细胞株、质粒pSuper-retro-puro（pSRP）和慢病毒包装系统（277、pMD2.G、pMDLg/pRR和pRSV-Rev）为本实验室保存。限制性内切酶等购自NEB 公司，LipofectamineTM2000 转染试剂盒、TRIzol 试剂、RNA 逆转录试剂盒和实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）所用的SYBR®Green kit 购自 Invitrogen 公司，RPMI 1640、DMEM 和胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司，细胞凋亡酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自Roche 公司，兔抗人TrkB 和小鼠抗人β-actin 等抗体购自Santa Cruze 公 司 ，Chemiluminescent HRP substrate 购 自MILLIPORE公司，引物合成和DNA测序由金唯智公司完成，实时定量PCR 仪器为ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 pSRP-iTrkB质粒的构建及鉴定 参考 Douma 等[4]方法设计针对人TrkB基因的shRNA 单链寡核苷酸片段，序列见表1。37 ℃退火1 h，连接到用BglⅡ和HindⅢ酶切过的pSRP 载体上，转化E.coliDH5α 感受态细胞获得重组质粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切pSRP-iTrkB转化子质粒和pSRP空载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定其是否含有插入片段，将阳性克隆送交华大基因公司通过DNA测序以验证其正确性。

1.2.2 277-iTrkB质粒的构建及鉴定 277-iTrkB质粒的构建按照本实验室已有方法[14]进行。用EcoRⅠ酶切pSRP-iTrkB质粒，T4 DNA聚合酶补平缺口，再次用XhoⅠ酶切线性化的质粒，得到含有H1启动子和shRNA发夹结构的DNA片段（约320 bp），切胶回收后将其连接到用EcoRⅤ和XhoⅠ酶切过的277 载体，转化E.coliDH5α 感受态细胞，获得重组质粒。用BamHⅠ和XhoⅠ酶切277-iTrkB转化子质粒和277空载体，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。

Tab.1 The primer sequence used in this study表1 实验所用引物序列

1.2.3TrkB-shRNA慢病毒的包装与感染SW620细胞 按照LipofectamineTM2000试剂盒的操作步骤，将277-iTrkB或阴性对照277-iLuc质粒中加入3种慢病毒包装辅助质粒pMD2.G、pMDLg/pRR 和 pRSV-Rev 进行 HEK-293T 细胞转染，获得含有TrkB-shRNA或阴性对照iLuc-shRNA慢病毒的培养液，将其感染SW620 细胞，构建稳定感染细胞系。具体步骤：用上述慢病毒培养液培养细胞12 h，更换为正常培养基培养12 h，如此反复3次。用荧光显微镜观察并统计随机视野1×103个细胞中GFP 阳性细胞比例以确定感染效果，感染效率=GFP阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 实时定量PCR 检测TrkB基因在mRNA 水平的沉默效果 常规培养SW620-iTrkB和SW620-iLuc细胞，采用TRIzol法提取总mRNA，一步法逆转录试剂盒获得cDNA，实时定量PCR检测各样本中目的基因TrkB和内参基因GAPDH的表达量。反应体系按照SYBR®Green kit 说明书配置，反应程序：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法进行相对定量，计算TrkB基因的相对表达量和沉默效率，实验重复3次。

1.2.5 Western blot 法检测TrkB 蛋白的表达 培养SW620-iLuc和 SW620-iTrkB细胞，提取总蛋白，采用 Western blot 法检测TrkB基因在蛋白质水平的沉默效果。将等量两份的蛋白样品用10%分离胶进行SDS-PAGE电泳后，均用湿法将蛋白转移至PVDF 膜，5%牛奶封闭1 h，TBST 洗膜后分别用兔抗TrkB 多克隆抗体（sc-8316，5%脱脂牛奶1∶1 000 稀释）和小鼠抗β-actin 单克隆抗体（sc-47778，5%脱脂牛奶1∶5 000稀释）孵育过夜，经TBST洗膜后分别使用羊抗兔IgG-HRP二抗（sc-2004，5%脱脂牛奶1∶10 000稀释）和羊抗鼠IgG-HRP（sc-2005，5%脱脂牛奶1∶10 000稀释）孵育2 h，再次TBST洗膜后用Chemiluminescent HRP substrate 作用在PVDF 膜上3 min，在暗室中曝光于X 射线胶片上。实验重复3 次，实验结果采用Image J软件与SPSS 17.0软件进行分析。

1.2.6 ELISA 检测SW620-iTrkB细胞的失巢凋亡水平 用6 g/L poly-HEMA 包被 6 孔板，将 SW620-iLuc和 SW620-iTrkB细胞分别均接种于普通6 孔板和poly-HEMA 包被6 孔板中，培养16 h 后，细胞计数板计数，再使用细胞凋亡ELISA 检测试剂盒分别检测贴壁和悬浮2 种生长状态下SW620-iLuc和SW620-iTrkB细胞的 405 nm 和 490 nm 波长光密度（optical density，OD），细胞凋亡率表示为OD差值：OD405-OD490。接种于普通6 孔板中的细胞处于贴壁生长状态，而接种于poly-HEMA 包被6 孔板中的细胞处于悬浮状态，细胞在贴壁生长状态和悬浮状态的凋亡水平的差异体现了细胞的失巢凋亡水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，2 组间比较用独立样本t检验，析因设计资料采用两因素两水平析因设计方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pSRP-iTrkB质粒及测序结果 酶切pSRP-iTrkB转化子质粒，得到了 320 bp 的 DNA 条带，而酶切空载体得到250 bp的DNA条带，说明pSRP-iTrkB转化子质粒含有DNA 插入片段，见图1。该重组质粒送交华大基因公司进行DNA测序结果显示，插入片段序列与设计的shRNA 寡核苷酸序列完全一致，说明pSRP-iTrkB质粒构建正确。

Fig.1 Identification of pSRP-iTrkB plasmid by enzyme digestion图1 pSRP-iTrkB质粒的酶切鉴定

2.2 277-iTrkB质粒构建结果 酶切277-iTrkB转化子质粒，得到了850 bp的DNA条带，而酶切277空载体得到530 bp 的DNA 条带，见图2。证实277-iTrkB重组质粒构建成功。

2.3TrkB-shRNA 慢病毒的包装与SW620 细胞感染 慢病毒培养液培养细胞后，在荧光显微镜下可见大多数细胞为GFP 表达阳性，见图3。感染效率达85%以上，说明慢病毒TrkB-shRNA 成功感染SW620细胞并稳定表达。

2.4 SW620-iTrkB细胞中 TrkB 的 mRNA 和 蛋 白 表达水平变化 与SW620-iLuc组相比，SW620-iTrkB组细胞中TrkB 的mRNA 和蛋白相对表达水平均降低（P＜0.05），见表2、图4。

Fig.2 Restriction enzyme digestion of 277-iTrkB plasmid图2 277-iTrkB质粒的酶切鉴定

Fig.3 Fluorescence observation of SW620 cells infected by TrkB-shRNA lentivirus(×20)图3 TrkB-shRNA慢病毒感染SW620细胞的荧光观察（×20）

Tab.2 Changes of expression level of TrkB mRNA in SW620 cells表2 SW620细胞中TrkB表达水平的变化 （n=3，±s）

Tab.2 Changes of expression level of TrkB mRNA in SW620 cells表2 SW620细胞中TrkB表达水平的变化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

组别SW620-iLuc组SW620-iTrkB组t TrkB mR NA 1.000±0.000 0.122±0.020 74.313＊＊TrkB 蛋白1.000±0.000 0.066±0.010 159.415＊＊

Fig.4 Western blot detection of TrkB protein level图4 Western blot法检测TrkB蛋白表达

2.5 贴壁组和悬浮组SW620-iTrkB细胞的失巢凋亡水平 不同生长状态和不同转染质粒转染均对SW620-iTrkB细胞的失巢凋亡水平均有影响，存在交互效应（P＜0.05）。各单独效应下，与贴壁状态相比，悬浮状态下SW620-iLuc组和SW620-iTrkB组细胞凋亡率均明显上升（P＜0.05）；在悬浮状态下，SW620-iTrkB组细胞凋亡率明显高于SW620-iLuc组（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Cell Death ELISA detection of cell anoikis levels表3 Cell Death ELISA检测细胞失巢凋亡水平（n=3，±s）

Tab.3 Cell Death ELISA detection of cell anoikis levels表3 Cell Death ELISA检测细胞失巢凋亡水平（n=3，±s）

＊P＜0.05；A：不同生长状态；B：质粒转染

生长状态贴壁悬浮组别SW620-iLuc组SW620-iTrkB组SW620-iLuc组SW620-iTrkB组FA×B FAFB细胞计数（个）83.758±1.196 74.942±5.343 41.975±7.475 42.933±13.994 57.991＊0.658 1.018细胞凋亡率0.376±0.100 0.412±0.109 1.207±0.228 2.173±0.159 203.421＊30.421＊26.188＊

3 讨论

正常的上皮或内皮细胞具有黏附依赖性，这些细胞从原位脱落后会引发细胞的程序化死亡过程即失巢凋亡[2，15]。近年来，人们越来越多地认识到抑制肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗特性是抑制肿瘤转移的一种有效手段[16]。TrkB 是神经营养酪氨酸激酶受体（neurotrophic tyrosine kinase receptor，NTKR）的家族成员之一，其配体是脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophic factor，BDNF）[17]。近年来的大量研究表明，TrkB 是一个强力的失巢凋亡抑制因子，利用药物或RNA 干扰技术在肿瘤细胞中失活TrkB是抑制肿瘤转移的有效手段[3，8，18-19]。

研究认为，在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤细胞中，靶向沉默TrkB基因的表达能够有效恢复肿瘤细胞对失巢凋亡的敏感性，但在高转移能力的结直肠癌细胞中的相关研究少见[3，19]。本研究成功构建了特异性靶向沉默TrkB基因的shRNA 表达载体并包装产生TrkB-shRNA 慢病毒，将其感染到恶性程度较高的人结肠癌细胞SW620中，检测发现该慢病毒能够在mRNA 和蛋白水平显著下调，表明其抑制了TrkB基因的表达，ELISA实验检测发现SW620细胞下调TrkB基因的表达能够显著降低细胞的抗失巢凋亡能力，考虑可能是由于细胞脱离基质后启动的失巢凋亡途径造成，且不同生长状态和不同转染质粒转染均对SW620-iTrkB细胞的失巢凋亡水平有影响，存在交互效应，表明SW620 细胞下调TrkB基因的表达能够使肿瘤细胞对失巢凋亡的敏感性显著增加，悬浮状态下其影响更大。

综上，本研究构建的慢病毒干扰载体可以对结肠癌细胞SW620中的TrkB基因产生长期、高效且稳定的下调效果；另外，在结肠癌细胞SW620 中下调TrkB 的表达能有效抑制肿瘤细胞的失巢凋亡抗性，从而可能有效抑制结肠癌细胞的转移，这为结肠癌的治疗提供了一种新的思路。