银杏内酯B多晶型的制备、表征与性质研究

李秋亚，孙 婷，王东凯



银杏内酯B多晶型的制备、表征与性质研究

李秋亚1,2，孙 婷2，王东凯1*

（1. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 沈阳沃森药物研究所，辽宁 沈阳 110016）

研究银杏内酯B多晶型的制备、表征与性质。对银杏内酯B进行多晶型筛查，并制备了6种不同的晶型（A～F型），分别采用单晶X射线衍射法（SXRD）、差示扫描量热法（DSC）、热重分析法（TG）对样品进行表征分析，并进一步研究银杏内酯B不同晶型对谷氨酸导致的PC12细胞损伤保护作用的优劣。各晶型PXRD、DSC、TG图谱均存在明显的差异，可用上述方法进行鉴别。无溶剂晶型F型为稳定晶型，通过细胞实验证明了晶型F对PC12细胞的保护作用更强。银杏内酯B晶型F为优势用药晶型。

药剂学；多晶型；晶型制备；表征分析；银杏内酯B

药物的分子排列结构不同产生的两种或两种以上晶格的结构，形成了多种晶型的现象，这种药物通常称之为多晶型药物。由于结构导致的理化性质的差异，不同的晶型在外观、颜色、硬度、密度、溶解度、熔点以及溶出率等方面存在显著的差异，以此导致了药物在安全性、稳定性以及疗效方面的不同[1-4]。

银杏内酯B（ginkgolide B）来源于银杏叶，分子式为C20H24O10，原料是白色结晶性粉末。银杏内酯B属银杏二萜内酯类化合物，有抗血小板聚集[5]、对缺血损伤的保护[6-7]、抗动脉粥样硬化及抗炎[8-9]等药理作用，主要用于缺血性心脑血管疾病的治疗。

银杏内酯B存在多晶型现象，作者通过溶剂去除法、温度转晶法等共发现6种晶型物质。采用粉末X射线衍射法（PXRD）、差示扫描量热法（DSC）和热重分析法（TG）等不同晶型分析技术对获得的晶型物质进行表征分析研究，并通过研究银杏内酯B不同晶型对谷氨酸导致的PC12细胞损伤的保护作用，比较银杏内酯B不同晶型的药理作用，以明确银杏内酯B的优势药用晶型。

1 仪器与材料

D8 AdvanceX射线衍射仪、SMART APEX-Ⅱ单晶X射线衍射仪(德国Bruker-AXS公司)，TGA 8000热重分析仪（美国PerkinElmer公司），SmarVapor RE-501旋转蒸发仪（德国SmarVapor公司），VAC真空干燥箱、HH电热恒温鼓风干燥箱（广东宏展科技有限公司）,1000TH药品稳定性实验箱（北京兰贝石恒温技术很有限公司），UPH-IV超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

谷氨酸、DMSO、MTT（美国Sigma公司），LDH试剂盒（南京建成生物公司），Fura-2 /AM、RIPA裂解液、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（碧云天生物公司），高分化PC12细胞（中科院上海细胞所）。

2 方法与结果

2.1 银杏内酯B多晶型的制备

2.1.1 晶型A的制备

称取样品50 mg，在50 ℃的条件下溶于1 mL乙腈中，向溶液中缓慢滴加1 mL水，冷却至室温析晶，静置1 d后抽滤，滤饼于40 ℃真空干燥4 h，获得晶型A样品。

2.1.2 晶型B的制备

称取样品50 mg加至2 mL甲醇中，置于40 ℃水浴中加热待样品完全溶解后，使用旋蒸仪快速去除溶剂，设定温度35 ℃、气压90 kPa、转速90 r∙h-1，所得固体物质即晶型B样品。

2.1.3 晶型C的制备

称取样品50 mg加至4 mL二氧六环中，置于40 ℃水浴中加热待样品完全溶解后，使用旋蒸仪快速去除溶剂，设定气压90 kPa 、转速90 r∙h-1、温度35 ℃，所得固体物质即晶型C样品。

2.1.4 晶型D的制备

称取样品50 mg加至3 mL DMSO中，置于40 ℃水浴中加热完全溶解后，缓慢加入1 mL水，冷却至室温析晶，静置2 d后抽滤，滤饼于40 ℃真空干燥4 h，获得晶型D样品。

2.1.5 晶型E的制备

称取样品50 mg加至2 mL吡啶中，置于40 ℃水浴中加热完全溶解后，缓慢加入1 mL水，冷却至室温析晶，静置1 d后抽滤，滤饼于40 ℃真空干燥4 h，获得晶型E样品。由于晶型E样品不稳定，所以后面的研究未对该晶型进行测定。

2.1.6 晶型F的制备

称取样品100mg，放入电热恒温鼓风干燥箱中，设定温度为200℃，静置30 min，获得晶型F样品。

2.2 五种晶型样品的物质状态表征

采用PXRD、DSC、TG等不同原理的分析方法，对实验中获得的银杏内酯B 5种不同的晶型进行表征分析，结果4种晶型样品为含有结晶溶剂物质，只有1种为无结晶溶剂物质。

2.2.1 PXRD法表征

取上述制得的晶型A～D和F共5种样品，分别称量50 mg，使用粉末X射线衍射仪测定。使用的X射线发生器：CuKa，40 kV，150 mA。扫描范围2= 3°～80°，扫描速度8°∙min-1，扫描步长为0.02°，接收狭缝RS = 0.15 mm。5种样品的PXRD测定结果见图1。

结果表明，各晶型的粉末X射线衍射图谱（2范围3°～80°）中衍射峰的位置、数量、强度等均存在明显的差异，因此可以利用PXRD法对实验中不同晶型样品进行鉴别。其中，银杏内酯B晶型A与原料药一致，银杏内酯B晶型B～D样品为晶态物质。

2.2.2 DSC法表征

称取银杏内酯B晶型A～D、F样品各3 mg放于铝制坩埚中，使用差示扫描量热仪进行DSC法测定，初始温度30 ℃，升温速率10 ℃∙min-1，温度上限500 ℃，测定结果见表1。

Table 1 DCS results of five crystal forms of ginkgolid B

结果表明，银杏内酯B各晶型的DSC图谱有明显差异，吸热峰、放热峰位置均不相同，因此可以使用DSC法进行鉴别。银杏内酯B四种晶型A～D在高温条件下发生转晶，向晶型F转变。晶型F在高温状态下无变化。

2.2.3 TG法表征

分别精确称量晶型A 6.75 mg、晶型B 7.98 mg、晶型C 7.44 mg、晶型D 9.35 mg和晶型F 8.12 mg，放置于铝制坩埚中，使用热重分析仪进行TG法测定银杏内酯B五种晶型样品含有结晶溶剂量。仪器设定初始温度30 ℃，升温速率10 ℃∙min-1，温度上限500 ℃。实验结果见表2与图2。

Table 2 TG results of five solid phases of ginkgolide B

Note：——It means there is no solvent

从图2中可以看出，银杏内酯B晶型A～D均有明显的失重台阶，且存在差异。通过计算确定银杏内酯B 5种晶型的结晶溶剂含量，晶型A含有1.1个水，晶型B含有0.9个甲醇，晶型C含有0.8个二氧六环，晶型D含有0.9个DMSO。也证明了银杏内酯B晶型F为无溶剂合物。在一定条件下，各晶型均向晶F型转变。

2.3 银杏内酯B晶型A和F对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用

因为晶型F不含有机溶剂且稳定性较好，为确定晶型F是否为优势药用晶型，对比晶型F与原料药（晶型A）的差异，设计了不同的药理实验。

2.3.1 银杏内酯B对谷氨酸处理PC12细胞内钙离子浓度的影响

取对数生长期的PC12细胞，调节细胞浓度至1×105mL-1，接种至24孔板中，并按照预设谷氨酸以及药物浓度进行处理。处理结束后每孔加入终浓度为1 μmol∙L-1的Fura-2/AM探针并重新放于培养箱中孵育15 min，PBS溶液冲洗2次，置多功能酶标仪检测，激发波长为355 nm，发射波长为538 nm。按试剂盒说明检测细胞内钙离子浓度。

2.3.2 银杏内酯B对谷氨酸处理PC12细胞LDH释放量的影响

取对数生长期的PC12细胞，调节细胞浓度至1×105mL-1，接种至24孔板中，并按照预设谷氨酸以及药物浓度进行处理。处理结束后收集各组细胞上清液100 μL，按试剂盒说明测定LDH活性。空白对照孔的PC12细胞经裂解后释放出全部的LDH，作为LDH的参比总浓度同时计算其他各组的LDH浓度，分别除以LDH总浓度，进而计算得到各组释放LDH的百分比。

2.3.3 银杏内酯B对谷氨酸处理PC12细胞MDA水平的影响

取对数生长期的PC12细胞，调节细胞浓度至1×105mL-1，接种至24孔板中，并按照预设谷氨酸以及药物浓度进行处理，PBS溶液冲洗2次，加入裂解液裂解细胞，随后取上清液分别于532 nm测定吸光度值，实验结果见图3。

A—The effects of ginkgoide B on influencing the concentration of intracellular Ca2+ of glutamate-treated PC12 cells. B—The effects of ginkgoide B on influencing the LDH release of glutamate-treated PC12 cells. C—The effects of ginkgoide B on influencing the intracellular MDA levels of glutamate-treated PC12 cells. Results were presented as mean ± S.E.M. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey's HSD test. ***P< 0.001 vs. the control group. ###P < 0.001, ##P < 0.01 vs. the Glu group. ### $P< 0.05 vs. the Glu + GB-A group

结果表明：银杏内酯B原药与晶型F均能显著降低谷氨酸导致的细胞内钙离子浓度升高，且银杏内酯B晶型F的抑制作用更加明显，差异具有统计学意义；银杏内酯B原药与晶型F均能够显著抑制谷氨酸导致的PC12细胞LDH的释放，但原药与晶型F相比无显著性差异；银杏内酯B原药与晶型F均能显著降低谷氨酸导致的细胞内MDA水平的升高，且银杏内酯B晶型F的抑制作用更加明显，差异具有统计学意义。综合以上结果，银杏内酯B晶型F在保护PC12细胞的药理作用上优于银杏内酯B晶型A。

3 结论与讨论

作者通过多种晶型筛查技术确定了银杏内酯B不同晶型的制备条件。分别采用单晶X射线衍射法（SXRD）、粉末X射线衍射法（PXRD）、差示扫描量热法（DSC）和热重分析法（TG）对各晶型样品进行表征分析，各个晶型的物理化学性质差异较大，易于区分。并研究银杏内酯B晶型A和F对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用，使用钙超载、细胞膜通透性以及氧化应激等分子机制比较银杏内酯B晶型A和F的药理作用，初步确定晶型F为优势药用晶型。接下来的研究将主要集中在不同剂型中银杏内酯B晶型F作为优势药用晶型与原型药作用的差异。

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Polymorphism preparation and characterization of ginkgolide B

LI Qiuya1,2, SUN Ting2, WANG Dongkai1*

(1.,,110016,; 2.,110016,)

To explore the preparation, characterization and properties of ginkgolide B-related polymorphs.By the methods of single crystal X-ray diffraction (SXRD), powder X-ray diffraction (PXRD), differential scanning calorimetry (DSC) as well as thermogravimetric analysis (TG), six kinds of crystal structure of ginkgolide B (form A-F) were prepared. To confirm the dominant crystal form of ginkgoide B, the protective effects of different crystal structures of ginkgolide B were further detected on glutamate-treated PC12 cells.The results indicated that there were significant differences among the crystal structures of ginkgolide B by using PXRD, DSC and TG. Furthermore, we observed that the form F was the most stable crystal form and showed better neural protective effects compared with the original form.The form F is the dominant crystal form of ginkgoide B.

pharmaceutics; polymorphs; polymorphs preparation; polymorphs characterizations; ginkgolide B

2019-04-01

李秋亚(1990-), 男(汉族), 辽宁沈阳人, 硕士研究生, E-mail 460345214@qq.com;

王东凯(1962-), 男(汉族), 辽宁沈阳人, 教授, 博士, 博士生导师, 主要从事药物新技术与新剂型的研究, Tel. 024-43520528, E-mail wangdksy@ 163. com。

R94

A

（2019）04–0100–07

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.002

(本篇责任编辑：赵桂芝)