大黄虫丸对颈动脉粥样硬化家兔颈动脉狭窄程度、血脂指标及斑块的影响研究

方永军，胡亚莉，范小璇，兰杨，徐泽彪，周锋，胡珍渊，韦鹏方

颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）是一种慢性进展性炎性病理过程，以颈动脉管壁增厚变硬、弹性消失及管腔缩小为主要特点，其发病过程包括脂质氧化沉积、炎性细胞迁移、内皮细胞损伤、平滑肌增殖等多个环节［1］。颈动脉粥样硬化斑块形成是颈动脉狭窄的主要危险因素之一，易损斑块脱落可导致脑血管急性闭塞，可严重威胁患者生命安全，目前CAS治疗以调脂、抗血小板聚集、抗氧化及钙拮抗剂等为主要原则［2］。中医学理论认为，动脉粥样硬化（AS）的主要病机为瘀、痰、湿、毒，多由肝、脾、肾等脏腑功能失调所致。吴以岭院士认为，AS由痰、瘀、毒阻滞损伤脉络所致［3］。国医大师张学文认为，痰浊阻于脉络，气机不利，久则瘀血内生，痰瘀胶结，留于颈部脉道，最终导致颈动脉粥样硬化斑块形成［4］。大黄虫丸是破血逐瘀之峻剂，由（熟）大黄、黄芩、（生）地黄、虫、水蛭、蛴螬、虻虫、桃仁、杏仁、芍药、干漆、甘草12味中药提炼而成，具有祛瘀血、清瘀热、滋阴血、润燥结等功效。近年研究表明，大黄虫丸治疗脑出血、脑梗死、高脂血症、CAS的效果较好［5］。目前，大黄虫丸治疗CAS的具体作用机制尚不十分清楚。本研究旨在探讨大黄虫丸对CAS家兔颈动脉狭窄程度、血脂指标及斑块的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验于2017年11月—2018年1月完成。选取3～4月龄的同批次健康日本大耳白兔40只，雌雄各20只，体质量2.0～2.5 kg，均购自西安交通大学医学院实验动物中心〔动物许可证号：SCXK（陕）2014-003〕。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 普通颗粒饲料（西安交通大学医学院实验动物中心提供），高脂饲料按胆固醇2%+花生油6%+普通颗粒饲料92%的比例加工配制，大黄虫丸（西安正大制药有限公司生产，国药准字Z61021089），阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司生产，国药准字H20051408），3%戊巴比妥，0.9%氯化钠溶液，碘伏，75%医用酒精，10%甲醛，碘海醇，注射用青霉素钠（80万U，哈药集团制药总厂生产，国药准字H23021439），肝素钠注射液（天津生物化学制药有限公司生产，国药准字H12020505），三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司生产）。

1.2.2 主要仪器 兔台，电子秤（万佳利 ACS-30，产品编号：324795），精密电子秤〔塞多利斯科学仪器（北京）有限公司生产〕，4 F单弯造影管（Cordis），泰尔茂泥鳅导丝，显微手术器械，动脉夹，注射器，26 G静脉输液针，医用氮气，精密玻璃转子气体流量计，灌胃针，普通采血管，Eppendorf管，载玻片。低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂生产，型号：TDL-80-2B），DSA血管造影机（AXIOM Artis dTA），光学显微镜（品牌：OLYMPUS，型号：DP73），切片机（德国MICROM公司生产，型号：HM 325），漂烘片机（常州市雅博电子设备有限公司生产，型号：YABO 200）。

1.3 模型制备 参考文献［6］行颈动脉内膜气体干燥损伤法制备CAS模型，具体如下：术前禁食12 h，经耳缘静脉注射3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉家兔，于右侧颈动脉搏动处脱毛（直径约15 cm），消毒后仰卧固定于兔台，采用无菌手术技术分离右侧颈总动脉12 mm。动脉夹孤立血管长约8 mm，孤立段近端刺入26 G静脉输液针并于远端穿出血管后退回针头于管腔内。由穿刺针向被隔离的颈动脉段注入0.9%氯化钠溶液2 ml，再接医用氮气，120 ml/min吹15 min。之后采用0.9%氯化钠溶液置换出管腔内气体，恢复血流，压迫止血。术后肌肉注射青霉素20万U。

1.4 分组及给药方法 所有家兔适应性喂养1周，采用随机分层方法分为A、B、C、D、E 5组，每组8只，雌雄各4只。5组家兔饮水（纯净水）不限，自由摄食100 g/d，根据人与家兔用药量换算表（60 kg成年人与1.5 kg家兔折算系数为2.30）计算药物用量，每周测量体质量并调整药物用量。A组家兔给予普通饲料喂养，纯净水10 ml灌胃，1次/d；B组家兔模型制备后给予高脂饲料喂养，纯净水10 ml灌胃，1次/d；C组家兔模型制备后给予高脂饲料喂养，阿托伐他汀钙2.5 mg•kg-1•d-1+纯净水10 ml灌胃，1次/d；D组家兔模型制备后给予高脂饲料喂养，大黄虫丸 1.5 g•kg-1•d-1+ 纯净水 10 ml灌胃，1次/d；E组家兔模型制备后给予高脂饲料喂养，大黄虫丸3.0 g•kg-1•d-1+纯净水 10 ml灌胃，1次 /d。5组家兔均连续灌胃8周。

1.5 数字减影血管造影（DSA） 5组家兔均于灌胃8周后行颈动脉DSA检查，参考沈长银等［7］造影方法，术前禁食12 h，饮水不限，于右腹股沟区脱毛备皮（直径约8 cm），耳缘静脉注射3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉家兔，麻醉起效后仰卧固定于自制兔台并移至DSA手术床。切开右侧腹股沟区皮肤长约5 cm，钝锐性结合分离、暴露右股动脉长约3 cm。股动脉切小口并置入泥鳅导丝，4 F单弯造影管尾接旋转止血阀，肝素盐水持续冲洗，在导丝辅助下置入主动脉弓造影并留取图像，采用Photoshop软件精确测量造影片颈动脉最狭窄区最小残腔直径（DMS）和狭窄远端正常颈总动脉直径（DCC），狭窄率=（DCC-DMS）/DCC×100%。以狭窄率＜30%为轻度狭窄，30%～69%为中度狭窄，70%～99%为重度狭窄，100%为闭塞。

1.6 血脂指标检测方法 5组家兔均于灌胃8周后采集耳缘静脉血5 ml并置于普通采血管中，室温下静置2 h，3 000 r/min离心10 min（离心半径13 cm），将上清液转移至1.5 ml Eppendorf管中并置于-80 ℃冰箱中保存待测。采用酶比色法检测血清TG、TC、LDL-C及HDL-C水平。

1.7 病理形态学 采用放血法处死所有家兔，各组取双侧颈动脉约1 cm，肉眼对比观察其形态差异；留取右侧颈动脉，0.9%氯化钠溶液轻轻冲洗后吸干水分，置于10%甲醛液中固定，石蜡包埋，切成5 μm薄片，行HE染色，光镜下观察其病理学改变并拍照。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验；等级资料分析采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 颈动脉狭窄程度 灌胃8周后，5组家兔颈动脉狭窄程度比较，差异有统计学意义（u=19.647，P=0.001）；其中B组家兔颈动脉狭窄程度重于A、C、E组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1、图1）。

2.2 血脂指标 灌胃8周后，5组家兔血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组家兔血清TG、TC、LDL-C水平高于A、C、E组，血清HDL-C水平低于A、C、E组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组家兔血清TG水平低于B组，C组家兔血清TC水平低于E组，D组家兔血清HDL-C水平低于E组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 5组家兔灌胃8周后颈动脉狭窄程度比较（只）Table 1 Comparison of degree of carotid stenosis in the five groups of rabbits after 8 weeks of gavage

表2 5组家兔灌胃8周后血脂指标比较（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups of rabbits after 8 weeks of gavage

表2 5组家兔灌胃8周后血脂指标比较（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups of rabbits after 8 weeks of gavage

注：TG=三酰甘油，TC=总胆固醇，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇；与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与E组比较，cP＜0.05

组别 只数 TG TC LDL-C HDL-C A组 8 1.226±0.307 3.018±0.215 0.486±0.242 1.984±0.150 B 组 8 3.098±0.485a 5.520±0.554a 2.533±0.753a 1.090±0.269a C 组 8 1.703±0.192b 4.005±0.736bc 1.362±0.397b 1.635±0.339b D组 8 2.356±0.202b 5.047±0.752 1.915±0.319 1.371±0.237c E 组 8 1.777±0.174b 4.792±0.512b 1.623±0.429b 1.658±0.200b F值 22.389 42.588 21.165 13.820 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 病理形态学

2.3.1 肉眼观察 A组家兔右侧颈动脉色淡红，柔软有弹性，光泽度良好，管腔内膜光滑；B组家兔右侧颈动脉颜色苍白，明显缺乏弹性，管壁僵硬、增厚，管腔变窄，其内可见淡黄色物质附着，不光滑；C、D、E组家兔右侧颈动脉颜色较B组色偏淡红，触之弹性尚可，其中D组家兔右侧颈动脉管腔内有少量附着物，C组和E组家兔右侧颈动脉管腔未见窄缩。

2.3.2 HE染色 HE染色结果显示，A组家兔动脉管腔无狭窄，管壁各层结构正常，内皮细胞完整，内膜光滑无明显增生，厚薄均匀，形状规则未见异常，中膜弹力纤维正常，平滑肌细胞（SMC）排列整齐、规则且无增殖迁移，外膜无炎性细胞浸润；B组家兔动脉管腔变小，表面凹凸不平，内膜薄厚不一，可见向腔内凸起的脂质斑块，内膜和中膜均出现大量炎性细胞浸润，中膜明显增厚，SMC增殖明显，排列明显紊乱，外膜可见炎性细胞浸润；A组和C组家兔光镜下动脉形态较为接近；D组和E组家兔动脉内膜均较A组增厚，厚薄不一，中膜SMC增殖，但较B组薄，外膜可见少量炎性细胞浸润；D组家兔相较于E组家兔动脉内膜偏厚，尚有轻微隆起，内皮下间隙增宽，可见迁移的SMC（见图2）。

3 讨论

CAS是急性脑梗死的重要发病原因之一，其可引起颈动脉管腔狭窄、脑血供减少，当狭窄持续加重或斑块脱落堵塞脑动脉时可造成脑血供急性阻断、神经系统缺血缺氧性损伤［8-9］。目前，CAS的发病机制尚未完全清楚，大量基础和临床研究表明，CAS的危险因素包括高脂血症、高血压、高血糖（糖尿病）、肥胖、吸烟［10］、自体生物活性物质（如5-羟色胺、一氧化氮、内皮素1等）代谢紊乱［11］、慢性应激［12］等，而解释CAS发病机制的学说包括脂质浸润学说（脂源性学说）、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）克隆学说、氧化应激学说［13］、血栓形成学说、损伤反应学说、炎症学说等。近年来随着人们对CAS发病机制的研究深入，发现炎性反应参与CAS的发生发展过程［14］。

图1 颈动脉DSA检查结果Figure 1 DSA examination results of carotid artery

图2 5组家兔右侧颈动脉光镜下病理学表现（HE染色，×10）Figure 2 Pathological manifestation of right carotid artery in the five groups of rabbits under light microscope

他汀类药物是临床广泛使用的调脂稳斑、逆转动脉粥样硬化的有效药物，阿托伐他汀钙是其代表药物，能有效降低血脂、稳定动脉粥样硬化斑块，甚至促进斑块消退，抑制炎性反应［15］。近年来中医药成为防治CAS的研究方向，其中活血化瘀药物是研究热点。刘梨等［16］研究表明，中医药可通过软坚散结作用而稳定斑块，促使斑块面积缩小甚至消退。贾运乔等［17］研究表明，活血化瘀药物大黄虫丸的调脂作用（降低LDL-C水平、升高HDL-C水平）是其抗AS机制。本研究结果显示，B组家兔颈动脉狭窄程度重于A、C、E组，提示大剂量大黄虫丸能有效减轻CAS家兔颈动脉狭窄程度，与阿托伐他汀钙治疗效果相似。本研究结果还显示，B组家兔血清TG、TC、LDL-C水平高于A、C、E组，血清HDL-C水平低于A、C、E组；D组家兔血清TG水平低于B组，C组家兔血清TC水平低于E组，D组家兔血清HDL-C水平低于E组，提示大剂量大黄虫丸能有效改善CAS家兔血脂代谢，但较阿托伐他汀钙治疗效果略差。