奶牛DQA2基因序列特征分析

陈朗，彭乔烽，刘云红，郑天宇，朱乔峰，刘丽霞

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

主要组织相容性复合体(Major histocompability complex, MHC)是由一组紧密连锁、高度多态的基因座组成的基因群，由Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因组成。Ⅱ类基因含 DQ、DO、DR 等亚区，其产物参与抗原递呈和T细胞激活。牛MHC简称BOLA[1]，根据遗传分型比较，BOLA II类基因被分成单独的区域Ⅱ类a区和Ⅱ类b区，相隔约三分之一染色体长度，这是牛和其他反刍动物MHC基因最显著的特征[2]。Ⅱ类a区包括功能性MHC Ⅱ类基因DR和DQ。牛有1个DRA基因座、3个DRB基因座、5个DQA基因座和5个DQB基因座，它们是由于基因复制而产生的，每个单倍型表达1个DR基因对（DRA和DRB）和1或2个DQ基因对[3,4]。在这些基因中，DRB3和DQA基因表现出高度多态性[5,6]。

近年来，有学者对牛DQA2基因多态性与生产和疾病的相关性做了大量研究。孙菲菲[7]研究认为DQA2外显子2中的等位基因A对渤海黑牛的生产性状起关键作用。Gelasakis[8]发现Chios奶牛的DQA2等位基因1101的单拷贝和基因型0301/0301与足癣的易感性相关。张通明[9]通过对各组表达谱差异分析，检出BOLA-DQA2与牛结核病感染的信号通路相关。Kosciuczuk等[10]对感染凝固酶阳性葡萄球菌的奶牛进行研究，结果发现BOLA-DQA2基因多态性与乳腺炎抗性相关联。这些研究说明DQA2基因可作为牛疾病抗性和易感性研究的候选标记基因。

为此，本研究通过测定荷斯坦牛DQA2基因序列再拼接得到CDS区（Coding sequence）序列，利用生物信息学方法，对荷斯坦牛DQA2基因CDS区序列编码的蛋白质的理化性质、疏水性/亲水性、N-糖基化位点、信号肽预测和蛋白质跨膜结构、二级结构和三级结构等进行分析，旨在为荷斯坦牛DQA2基因结构与功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从宁夏农垦贺兰山奶业有限公司牛群中采集中国荷斯坦牛尾静脉血，每头采集10mL，低温保存，带回实验室后-20℃冷冻保存。采用传统的酚-氯仿抽提法提取血液基因组DNA，提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2 引物设计

根据GenBank数据库中牛的DQA2基因序列（登录号：XM_024983852.1），利用NCBI在线软件Primer-BLAST设计BoLA-DQA基因4对引物（表1），引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 BoLA-DQA2基因引物信息表

1.3 基因组DNA混合池构建和PCR扩增

随机选取300个荷斯坦牛DNA样品，每50个样品构建一个DNA混合池，以混合池DNA为模板进行扩增。扩增体系为：PCR反应总体积20μL，其中混合DNA1μL，2×Power Taq PCR MasterMix （百泰克）11μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，灭菌超纯水补至20μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火（退火温度见表1）30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表2 BOLA-DQA2基因生物信息学分析方法

1.4 序列测定与生物信息学分析

选取扩增效果良好的DQA2基因4个外显子PCR扩增产物进行双向测序，用MEGA6.0和Editseq软件比对和拼接获得DQA基因CDS区序列。对BOLA-DQA基因CDS区进行分析用到的方法及工具见表2。

2 结果与分析

2.1 荷斯坦牛DQA2基因4个外显子扩增结果

由图1可以看出，PCR扩增产物电泳条带特异性良好，条带清晰，DQA基因4个外显子片段大小均与预期扩增片段相符。

图1 荷斯坦牛DQA2基因PCR扩增产物检测结果

2.2 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质理化特性预测与分析

蛋白质的基本性质包括相对分子质量、氨基酸组成和等电点等，利用Expasy服务器上的protparam程序预测结果见表3。荷斯坦牛DQA2基因编码254个氨基酸，20种氨基酸所占比例见图2。可以看出，亮氨酸( Leu)最多，占整个氨基酸组成的10.2%，半胱氨酸( Cys)最少，占1.2%。基因编码产物不稳定指数大于40，表明该基因编码产物不稳定[11]。

表3 荷斯坦牛 DQA2基因编码蛋白质理化特性

图2 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质氨基酸组成

2.3 荷斯坦牛 DQA2基因编码蛋白质疏水性/亲水性预测和分析

运用Expasy服务器上的Protscale程序预测荷斯坦牛DQA基因编码蛋白质的疏水性，结果（图3）显示，该蛋白质第235位苏氨酸（Thr）疏水性最强（+3.122），第51位的谷氨酸（Glu）和第52位的苯丙氨酸（Phe）亲水性最强（-1.900）。整个编码产物中，亲水氨基酸占55.28%，疏水氨基酸占45.72%，平均分值为-0.021，表现为亲水性，由此可推断荷斯坦牛DQA2基因编码的蛋白质是一种可溶性蛋白质。

图3 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质的疏水/亲水性预测

2.4 荷斯坦牛 DQA2基因编码蛋白质 N-糖基化位点的预测和分析

蛋白质糖基化是指在蛋白质合成的同时或合成后，在酶的催化下寡糖链被连接在特定的糖基化位点，形成糖蛋白。利用CBS在线分析软件Net NGlyc 1.0预测得到，荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质具有4个潜在的N-糖基化位点，分别为 Asn31、Asn96、Asn260、Asn369（图4）。

图4 荷斯坦牛 DQA2基因编码蛋白质 N-糖基化位点预测

2.5 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质信号肽分析

信号肽位于蛋白质N端，一般由16～26个氨基酸残基组成[12]。信号肽分析结果(图5) 显示，DQA2基因编码蛋白质的分值曲线较为典型，其中C值和Y值趋向于+1，S值在剪切位点之前较高而在剪切位点之后变低。荷斯坦牛DQA基因在第1～23位氨基酸之间存在信号肽，其切割点位于23～24位的氨基酸之间（信号肽剪切点主要根据Y最大值大于0.5来判断）。

图5 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质信号肽分析

2.6 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质跨膜结构域分析

利用TMHMM程序分析其跨膜结构域，从结果（图6）可以看出，DQA2编码的蛋白质共存在1个典型的跨膜螺旋区，氨基酸序号为217-239。由此可推测，荷斯坦牛DQA2基因CDS区所编码的蛋白质为跨膜蛋白。

图6 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质的跨膜区域预测结果

2.7 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质二级结构和三级结构预测与分析

蛋白质的二级结构是指多肽链主链折叠产生的由主链内和主链间周期性氢键维系的有规则构象，这些构象借助各种次级键共同构成其三级结构。荷斯坦牛DQA基因编码蛋白质二级结构预测结果(图7) 显示，二级结构组分中α-螺旋(Hh)占9.84%，β-折叠(Ee)占33.07%，无规则卷曲( Cc)占57.09%。其中Hh＜45%，Ee＞20%，因此判断荷斯坦牛DQA基因编码蛋白质二级结构为混合型[13]。其三级结构见图8，显示该蛋白质存在较多的无规则卷曲，结构较为复杂，同时也表明DQA2编码的蛋白质由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致。

图7 荷斯坦牛 DQA 基因编码蛋白质二级结构预测

图8 荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质三级结构预测

3 讨论

生物的性状由基因控制，却通过蛋白质直接表现。研究发现，DQA2基因参与外源性抗原的呈递，与免疫功能相关[14]，故DQA2成为与动物免疫机能密切相关的功能候选基因。侯钦雷[15]指出BOLA-DQA2-SV1在对奶牛乳腺炎抗性方面有重要作用。邢凤等[16]发现鲁波山羊GOLA-DQA2基因外显子2与血液免疫指标之间有一定的相关性。李灵[17]发现林麝Mobe-DQA2＊03与化脓性疾病的抗性显著相关，Mobe-DQA2＊05和Mobe-DQA2＊06与化脓性疾病的易感性呈显著相关。Chang等[18]发现HLA-DQA2位点与台湾男性汉族人群的持续性HBV感染有关。

对DQA2基因CDS区编码蛋白质的理化性质和高级结构的预测和分析对了解蛋白结构与功能之间的相关性有重要意义。本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法在荷斯坦牛DQA2基因CDS区检测到6个核苷酸突变位点。荷斯坦牛DQA2蛋白理论等电点为4.78，由此可判断荷斯坦牛DQA2蛋白是酸性蛋白质。研究表明蛋白质不稳定指数大于40为不稳定蛋白，反之则为稳定蛋白[19]，荷斯坦牛DQA2蛋白不稳定指数为42.50，属于不稳定蛋白。依据平均亲疏水性分值（-0.021）可判定荷斯坦牛DQA2蛋白是可溶性蛋白。蛋白质的稳定性取决于蛋白质半衰期的长短，荷斯坦牛DQA2基因编码的蛋白质半衰期为30h，但DQA2蛋白仍属于不稳定蛋白，这可能是不同基因调控所导致的结果。蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后加工的重要修饰之一，蛋白质糖基化修饰对蛋白质折叠、分选及其定位有重要影响，糖链结构不同还将影响蛋白质的半衰期和降解[20]。而糖基化位点发生变化可能与疾病的发生有关[21]。荷斯坦牛DQA2基因潜在的糖基化位点有可能与其乳房炎的发生密切相关。荷斯坦牛DQA2基因编码蛋白质具有4个潜在的N-糖基化位点，分别为 Asn31、Asn96、Asn260、Asn369。DQA2可能是有胞内区（240aa-254aa）、跨膜区（217aa-239aa）、胞外区（1aa-216aa）三部分组成的跨膜蛋白，它可能作为膜受体起作用，也可能是定位在膜上的锚定蛋白质或离子通道蛋白质。

本研究通过生物信息学和基因组学得出荷斯坦牛DQA2基因的功能和结构，可以为今后更好地研究荷斯坦牛的抗病育种提供重要的理论依据。