奶牛乳房炎病原菌金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

阚秋琪，刘康军，孙莹慧，李建基，崔璐莹，孟霞，朱国强，王亨

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009 )

奶牛乳房炎是奶牛养殖业最普遍、经济危害最严重的一种疾病，其病因复杂，通常由微生物引起，其中无乳链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌是最主要致病菌[1]。由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有治愈率低，复发率高的特点。同时，抗生素的滥用导致金黄色葡萄球菌的耐药性愈来愈强，严重阻碍了奶牛业的发展。本试验对从江苏某奶牛场乳房炎患牛奶样中分离的金黄色葡萄球菌进行了药物敏感性试验，筛选出有效药物，以期为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 奶样采集

经临床检查和CMT检测，共计从江苏某奶牛场收集55份乳房炎患牛奶样。

1.2 主要试剂及仪器

胰蛋白胨和酵母提取物，购自OXOID公司；Baird-Parker琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；琼脂粉，购自北京索莱宝科技有限公司；氯化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；质控标准品、甲酸、基质溶液和MALDI Biotyper微生物鉴定系统，购自德国布鲁克公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离纯化

将奶样摇匀后接种于Baird-Parker琼脂培养基，37℃培养18～24h，然后观察及记录菌落的形态，挑取疑似金黄色葡萄球菌的菌落，即黑色、周围有白色浑浊带，且最外围有一透明环的菌落，将其接种于LB固体琼脂培养基上进行纯化培养。

1.4 细菌的鉴定

使用MALDI Biotyper系统对纯化后的细菌进行鉴定。首先在MALDI靶板上加1μL质控标准品，自然干燥，然后将纯化后的单个菌落直接涂抹于其他位点，再加入70%的甲酸水溶液1μL，自然干燥，最后分别在质控标准品和菌落涂层上加1μL基质溶液，待其自然干燥后放入质谱仪，通过Flex Control和MALDI Biotyper RTC 筛选出特异性的指纹图谱，与Biotyper数据库进行比对，完成微生物的鉴定[2]。

1.5 耐药性试验

采用纸片扩散法进行药敏试验，对12种抗生素(青霉素、阿莫西林、头孢氨苄、庆大霉素、链霉素、四环素、丁胺卡那、卡那霉素、多西环素、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素)进行耐药性试验，判定标准见表1。

表1 耐药性试验判断标准

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

本试验从55份乳房炎奶样中共分离出8株金黄色葡萄球菌（编号分别为1～8），检出率为14.55%(8/55)。

2.2 耐药性试验

表2 8株金黄色葡萄球菌分离株的耐药结果 单位：mm，%

采用纸片扩散法对8株金黄色葡萄球菌进行了12种抗菌药物的耐药性试验。结果显示，金黄色葡萄球菌对12种抗生素均存在一定程度的耐药。其中，对青霉素、链霉素、环丙沙星的耐药率最高，均为100%，其次，对阿莫西林的耐药率也达到较高水平，为75%，极少数对头孢氨苄、庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素耐药，而8株金黄色葡萄球菌对四环素、多西环素均敏感，对克林霉素敏感或中敏（表2）。

3 讨论

在本次试验中，金黄色葡萄球菌的检出率为14.55%。查阅相关文献，田晓英等[3]报道天津地区生牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率为58%，田会丽等[4]报道石河子地区的金黄色葡萄球菌检出率为70.83%，两者均高于本试验结果；但与章慧等[5]报道的上海生牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率（13.33%）基本一致，Anderson等[6]报道的美国东南部地区牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率（13.6%）与本试验结果也基本一致，各地方的流行菌种不同可能是检出率差异性显著的原因。

本试验分离的8株金黄色葡萄球菌分离株均呈现多重耐药，对β-内酰胺类抗生素(青霉素、阿莫西林)的耐药水平极高，尤其对青霉素已产生完全耐药性，高于高潮等[7]报道的上海地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对青霉素的96.8%耐药率，低于其报道的对阿莫西林的100%耐药率；对氨基糖苷类抗生素中的链霉素达到完全的耐药率，远高于刘敬兰等[8]报道的北京地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对链霉素53%的耐药率，而对庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素的耐药率较低；对喹诺酮类抗生素中的恩诺沙星和环丙沙星的耐药率为100%，而对克林霉素敏感率达100%，前者耐药率远高于王冰等[9]报道的呼和浩特地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对喹诺酮类抗菌药21%～32%的耐药率；对头孢类的头孢氨苄的耐药率为25%，远低于张倩等[10]报道的石河子地区的66.67%耐药率；对四环素类抗菌药耐药率为0，远低于燕霞等[11]报道的浙江地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对四环素60%的耐药率。以上数据表明，各地区奶牛场的金黄色葡萄球菌分离株对各种抗生素的敏感程度存在很大差异，这可能是不同奶牛场不同用药习惯所导致的。

本试验的8株金黄色葡萄球菌分离株均呈现严重的耐药现象，其中对β-内酰胺类和喹诺酮类的抗生素耐药率极高，其原因可能与其所含耐药基因的活跃表达有关。目前已有研究结果表明，β-内酰胺类耐药基因为mecA、femA，氨基糖苷类耐药基因为aac(6＇)/aph(2＇＇)，喹诺酮类耐药相关基因为norA、gyrA、grlA，四环素类耐药基因为tetA、tetB、tetC、tetD，这些耐药基因可使金黄色葡萄球菌极易产生耐药性。不同地区、不同奶牛场的细菌耐药性存在差异，临床用药时需根据实际情况合理用药。

金黄色葡萄球菌能够导致乳腺细胞损伤，并能在上皮细胞或者吞噬细胞（如嗜中性粒细胞）中存活，故控制该菌引发的乳房炎最有效的方法是保持环境卫生、牛体清洁，减少或者消除牛群之间的传播，减少乳头污染和感染的机会，及时发现病牛并隔离，通过细菌分离鉴定和药敏试验选择敏感药物进行治疗或者淘汰。此外，通过加强饲养管理、补充维生素或者硒制剂[12,13]、平衡饲料中的铜和锌的水平，均可以在一定程度上减少该疾病的发生。