霉菌毒素吸附剂对荷斯坦牛产奶性能及免疫功能的影响

白阳，王泽栋，李莲，韩兆玉，王根林

（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）

在畜牧生产中，饲料霉菌毒素污染是一个持续性的全球性问题，霉菌毒素严重影响动物健康和生产性能，并带来重大食品安全隐患。统计表明，我国每年有大约20%的饲料由于被霉菌毒素污染而导致浪费[1]。饲料中常见的并且具有较大危害性的霉菌毒素有黄曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、呕吐毒素（DON）、伏马毒素（FUM）等[2]。这些霉菌毒素在饲料中过量会导致动物肝脏、生殖器官、大脑、胃肠黏膜等损伤，甚至引起癌变。

虽然相较单胃动物，奶牛等反刍动物瘤胃内微生物具有降解及转化霉菌毒素的能力，但奶牛需要采食大量粗饲料以及各类副产品，由于原料制作、来源差异大，极易造成霉菌毒素超标，进而影响奶牛的健康和生产性能，而且有些霉菌毒素还会经瘤胃微生物转化为毒性更大的代谢产物[3,4]。因此，本试验通过在奶牛饲粮中添加霉菌毒素吸附剂，从而降低泌乳奶牛体内及牛奶中的霉菌毒素残留，为奶牛健康和原料奶安全提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

本试验于2018年3月6日～5月31日进行，试验地点设在宿迁市卫岗乳业泗洪兴旺奶牛养殖基地。

1.2 试验材料与试验设计

根据年龄、胎次、泌乳期和产奶量相近的原则，采用配对试验设计，将健康无疾病的中国荷斯坦牛30头，随机分为2组，每组15头。对照组饲喂基础饲粮；试验组在对照组的饲粮基础上，添加20g/（头·d）的复合型霉菌毒素吸附剂（脱毒清）。试验期总共70d，分为预饲期7d，正试期63d。吸附剂购于江苏神力特生物科技股份有限公司，产品主要组分为凹凸棒石、酵母培养物等。吸咐剂于每天早晨一次性投喂到试验牛饲粮中，其他饲养管理方式不变。

1.3 试验饲粮与饲养管理

试验牛均采取散养，每日于6∶00、13∶00和20∶00饲喂三次，每天的剩料量控制在5%以下。采用管道式挤奶设备日挤奶3次，自由饮水，常规光照，保持圈舍清洁干燥。

表1 试验日粮组成及其营养水平（干物质基础）

1.4 采样及样品分析

1.4.1 饲料样采集及处理

正试期采用自封袋按照四分法[5]收集饲料样及剩料样，于65℃烘箱烘2h制成风干样，粉碎，过40目筛，测定饲粮营养成分。粗蛋白质含量：采用凯氏定氮法测定；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量：采用Van Soest 洗涤纤维法测定；粗脂肪：采用索氏提取法测定；钙含量：采用高锰酸钾滴定法测定；磷含量：采用钒钼酸氨比色法测定。每隔20d抽样检测饲粮中AF、ZEA和FUM的含量，利用ELISA法进行测定。本试验ELISA试剂盒购自上海酶联生物公司。

1.4.2 奶样采集及处理

每7d试验期为一个周期，一个周期选一天测量2次产奶量并收集中午的奶样。奶样中加入重铬酸钾防腐剂（0.6mg/mL）混合均匀，于4℃冷藏，用于乳成分检测。用乳成分自动分析仪(CombiFoss FT+) 测定乳蛋白、乳脂、乳糖、总固形物、尿素氮及体细胞数，采用加权平均法计算正试期乳成分含量，并利用ELISA法测定乳中AFM1、ZEA和FUM残留含量。

1.4.3 血液采集及处理

在试验前和试验结束时分别于试验牛尾静脉采血10mL，血液样品经3 000r/min离心10min，分离血清，于-20℃保存，用于血清指标检测。血清指标包括：总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）及总抗氧化能力（T-AOC），并检测血清中AFM1、ZEA和FUM残留含量。其中TP、ALB、ALT、MDA、SOD、GSH、T-AOC试剂盒购自南京建成生物工程研究所，AFM1、ZEA、FUM、IL-1、IL-6、TNF-α采用ELISA法测定。

1.5 数据处理

所有试验数据采用 SPSS 25.0进行单因素方差分析和回归分析。试验结果以“平均值±标准误”表示，差异显著性判断标准为P＜0.05。

2 结果和分析

2.1 饲料中霉菌毒素含量

由表2可知，本试验所用的奶牛饲粮中含总黄曲霉毒素10.246μg/kg，玉米赤霉烯酮17.570μ g/kg，伏马毒素52.391μg/kg。根据《饲料卫生标准》（GB13078-2017），我国对三种霉菌毒素的相关限量标准为：奶牛饲粮中黄曲霉毒素B1含量不得高于10μg/kg，玉米赤霉烯酮含量不得高于500μg/kg，伏马毒素含量不得高于50 000μg/kg。本试验测得的黄曲霉毒素总量与黄曲霉毒素B1限量标准无法比较，玉米赤霉烯酮与伏马毒素含量均在安全范围以内。

表2 饲料中霉菌毒素含量

2.2 吸附剂对泌乳荷斯坦牛生产性能的影响

由表3可知，日粮中添加吸附剂的试验组奶牛产奶量有下降趋势，但与对照组相比差异不显著；日粮添加霉菌毒素吸附剂对奶牛乳成分无显著影响（P＞0.05）。其中，试验组4%标准乳略有增长，但差异不显著（P ＞0.05）。

表3 吸附剂对泌乳荷斯坦牛生产性能的影响

2.3 吸附剂对泌乳荷斯坦牛乳中多种霉菌毒素含量的作用

表4 吸附剂对泌乳荷斯坦牛乳中霉菌毒素的影响

由表4可知，经吸附剂处理，试验组奶牛乳中AFM1、ZEA含量与对照组相比显著减少（P＜0.05），AFM1吸附率为13.36%，ZEA吸附率为8.64%；乳中FUM含量有一定程度的降低（吸附率为3.75%），但差异不显著（P＞0.05）。

2.4 吸附剂对泌乳荷斯坦牛血清中多种霉菌毒素的影响

由表5可知，与对照组相比，试验组奶牛血清中的AFM1、ZEA、FUM含量均极显著降低（P＜0.01），血清中的AFM1吸附率为20%，ZEA吸附率为14.62%，FUM吸附率为13.88%。

表5 吸附剂对泌乳荷斯坦牛血清中多种霉菌毒素的影响

2.5 吸附剂对泌乳荷斯坦牛血清生化指标及抗氧化指标的影响

由表6可知，日粮中添加吸附剂后奶牛血清白蛋白、总蛋白、谷丙转氨酶含量均有所提高，但差异均不显著（P＞0.05）。试验组血清中SOD有上升的趋势，MDA有降低的趋势，但两组间差异不显著（P＞0.05）；GSH和T-AOC差异也均不显著（P＞0.05）。

2.6 吸附剂对泌乳荷斯坦牛免疫功能的影响

由表7可知，经吸附剂处理的试验组IL-1、I L-6水平都略有下降，但与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；试验组TNF-α含量显著降低（P＜0.05）。

表7 吸附剂对泌乳荷斯坦牛免疫功能的影响

3 讨论

3.1 霉菌毒素吸附剂对泌乳荷斯坦牛生产性能的影响

饲料是食物链中重要的一环，如动物摄入饲料造成体内有霉菌毒素残留，霉菌毒素可通过食物链中的奶、蛋、肉来影响人体健康[6]。常见的黄曲霉毒素（AF）主要有B1、B2、G1、G24种形式，其中AFB1毒性最强，是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，具有致癌作用，会造成血管通透性的严重破坏并造成中枢神经损伤。饲料中常见的另外一种霉菌毒素——玉米赤霉烯酮是具有导致生殖系统畸形作用的毒素，奶牛采食玉米赤霉烯酮污染的饲料，会造成免疫系统、繁殖系统的严重损害，并且玉米赤霉烯酮进入瘤胃后，其中90%转化为玉米赤霉烯醇，其毒性将会增强[7]。伏马毒素（FUM）对饲料的污染也是普遍存在的，主要污染对象为玉米、小麦等饲料原料，毒性作用于大脑。到目前为止，已鉴定出的FUM及其类似物共计28种，其中以毒性最强的FB1为主。以2017年为例，全国各省采集的各种饲料和饲料原料样品中，AFB1污染均比较普遍，其中粕类中AFB1污染最为普遍。各种饲料原料及配合饲料中ZEN的污染也普遍存在，玉米、玉米副产物、小麦及麸皮和全价料中检出率均在80%以上[8]。控制饲料霉菌毒素污染与危害是畜牧行业的共同愿望，目前在奶牛饲粮中添加霉菌毒素吸附剂是减少霉菌毒素对奶牛危害最直接、有效的方法。

本试验使用的复合型霉菌毒素吸附剂主要成分为凹凸棒石，其作为一种矿物黏土在养殖和饲料行业中有多方面的研究，被用作载体、抗结块剂、霉菌毒素吸附剂等[9]。Kane等[10]研究表明，矿物黏土如凹凸棒石、高岭土、蒙脱石能够除去坚果油中99%浓度为0.5g/L的AFB1。根据袁耀明等[1]的研究以及复合霉菌毒素产品公司针对奶牛饲粮推荐剂量，本试验最终采用的添加量为20g/（头·d）。本试验采用ELISA法检测各霉菌毒素含量，根据王蕾[11]的研究，与多种方法相比ELISA方法灵敏度高、干扰小，更适用于大样本的检测。

Dschaak等[12]在奶牛基础饲粮中添加一定量的具有吸附作用的硅铝酸盐，发现对乳脂率、乳中尿素氮浓度没有影响，但有提高乳蛋白率的趋势。王黎文等[13]研究表明奶牛饲粮中添加蒙脱石，对乳糖率、乳总固形物率无显著影响。本试验结果表明，试验组饲喂复合霉菌毒素吸附剂后，产奶量下降，乳脂率、总固形物上升，经计算4%标准乳上升，但与对照组相比均无显著差异，说明日粮中添加霉菌毒素吸附剂对奶牛生产性能影响不显著。

乳中体细胞数是反映乳房的健康程度和乳房炎发病率的重要指标。张克春等[14]研究显示，饲粮中添加以酵母细胞壁酯化葡甘露聚糖为主要成分的复合霉菌毒素吸附剂，可以降低乳体细胞数。王黎文[13]报道，添加0.5%对霉菌毒素有吸附效果的蒙脱石，显著降低了乳体细胞数，但随着饲粮中蒙脱石添加量的增大，乳体细胞数逐渐升高，这表明适量的霉菌毒素吸附剂能够在一定程度上降低体细胞数，而添加量过大反而对奶牛产生应激，不能起到降低体细胞数的作用。在本试验中，试验组与对照组乳中体细胞数差异不显著，提示日粮中添加复合霉菌毒素吸附剂不影响奶牛乳中体细胞数。

3.2 霉菌毒素吸附剂对泌乳荷斯坦牛血清和牛奶中霉菌毒素残留的影响

霉菌毒素对奶牛健康、繁殖、免疫功能均能造成危害，黄曲霉毒素经代谢后产生AFM1，毒性更大。已有试验证实，奶牛乳中的AFM1浓度与饲料中的AFM1含量呈正相关关系，AFB1转化为AFM1的比例在58～75∶1范围内，平均约66∶1。当奶牛采食饲粮干物质中AFB1达到3μg/L时，牛奶中AFM1就会达到0.5μg/L[15]。青年母牛以及发情前的奶牛对玉米赤霉烯酮很敏感，采食被污染的饲料后，明显表现出阴部发炎红肿、子宫增厚变大、青年母牛乳房提前发育、发情延迟等症状。玉米赤霉烯酮经瘤胃液转化为玉米赤霉烯醇，对奶牛繁殖性能产生影响。研究发现，采食含有一定量玉米赤霉烯醇饲料的奶牛，配种受孕率较对照组降低[16]。伏马毒素对动物的神经系统具有毒害作用，饲喂伏马毒素污染的饲料会导致脑白质软化症、玉米茎秆病、霉玉米中毒、脑炎等疾病，死亡率达到60%。伏马毒素具有致癌性，流行病学证明其与人的食道癌发生有关，研究发现，伏马毒素还会损害动物的免疫系统，导致免疫功能下降，造成免疫抑制、疫苗免疫后抗体水平不高，从而导致动物对疾病的抵抗力降低[17]。

霉菌毒素吸附剂对奶牛体内霉菌毒素残留有显著影响。汤明月等[18]研究表明，主要成分为硅铝酸盐和寡糖的霉菌毒素吸附剂对牛奶中的AFM1有显著吸附效果。黄谢江等[19]研究表明，奶牛专用霉菌毒素吸附剂对生乳中的AFM1、ZEA、DON残留均有显著降低作用。本试验中饲喂含霉菌毒素吸附剂饲粮的奶牛，其血清中AFM1、ZEA、FUM含量与对照组相比均极显著降低，AFM1、ZEA、FUM吸附率分别为20%、14.62%、13.88%；乳中AFM1、ZEA、FUM含量较对照组降低13.36%、8.64%、3.75%。本研究表明，复合霉菌毒素吸附剂可显著降低奶牛血清及牛奶中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及伏马毒素，从而提高原料奶的食品安全水平，保障人类健康。

3.3 霉菌毒素吸附剂对泌乳荷斯坦牛血清生化指标及抗氧化指标的影响

血液生化指标是机体正常生理功能和代谢过程的内在反映，通过测定血液生化指标可以间接了解家畜机体健康状况。总蛋白和白蛋白是反映机体蛋白质代谢情况的重要指标。谷丙转氨酶是动物体内重要的转氨酶，主要分布在肝脏、骨骼肌、肾脏等组织的细胞中，在肝脏中的活性最高，而在血液中的活性很低。当肝细胞受损时，大量的谷丙转氨酶进入血液，从而导致血液中酶含量升高[20]。本试验中，添加霉菌毒素吸附剂组与对照组相比，血清中总蛋白、白蛋白和谷丙转氨酶含量差异不显著，这是由于基础饲粮本身的霉菌毒素含量在国家规定范围内，微量的霉菌毒素还未达到改变机体蛋白质代谢和对奶牛肝脏造成损害的浓度。

泌乳牛机体代谢过程中会产生大量的自由基，而自由基的大量积累会导致细胞的不饱和脂肪酸产生MDA，MDA会促使细胞解体，导致细胞死亡[21]。SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶，能及时修复因自由基造成的损伤，是生物体内清除自由基的重要物质。GSH是机体内一种重要的过氧化物分解酶，能还原有毒的过氧化物，从而保护细胞膜的结构及功能不被过氧化物干扰及损害[22]。本研究中试验组奶牛血清中MDA水平有所降低，SOD有升高趋势，说明饲喂含复合霉菌毒素吸附剂饲粮，对奶牛机体没有带来不良影响。

3.4 霉菌毒素吸附剂对泌乳荷斯坦牛免疫功能的影响

IL-1是一种重要的促炎性细胞因子，也是一种重要的免疫调节因子，它参与神经、内分泌系统、机体炎症反应以及抗肿瘤生理过程，主要在细胞免疫激活中发挥调节作用[23]，并且在乳腺癌、肺癌、结肠癌中都有较高水平的表达[24]。IL-6和TNF-α为多功能细胞因子，在抗肿瘤免疫和炎症反应中起着十分重要的作用[25]。IL-6来源于单核细胞、活化的T细胞、B细胞、纤维母细胞、上皮细胞等，是一种具有复杂生理学功能的细胞因子。IL-6不仅参与机体的炎症反应和抗感染防御机制，还与一些肿瘤疾病的发生和转归密切相关[26]。TNF-α是一种具有直接抗肿瘤作用的细胞因子，它以自分泌的方式促进自身合成，在病变部位产生并选择性集中在该区域，主要参与抗感染、免疫调节与直接调节单核细胞的成熟及增强其活性，在机体免疫防御系统中起重要作用[27]。

根据研究可知，伏马毒素通过降低T、B淋巴细胞活性，抑制抗体、免疫球蛋白的产生，降低干扰素、补体的活性，还可以使巨噬细胞的形态发生改变、细胞活力减弱，进而损害巨噬细胞的功能[28]。研究显示，玉米赤霉烯酮可通过抑制免疫细胞因子的分泌，间接参与机体体液免疫和细胞免疫的负调节，不同剂量的玉米赤霉烯酮均能极显著抑制脾脏T、B淋巴细胞的增殖；不同浓度的玉米赤霉烯酮均能极显著抑制ConA活化的脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，并呈现剂量依赖性，高剂量会显著降低TNF-α、IL-8、 IL-1β、IL-6和IFN-γ等因子的基因和蛋白表达[29]。

本试验研究结果显示，与对照组相比，饲喂复合霉菌毒素吸附剂组其血清中IL-1、IL-6和TNF-α水平均下降，其中TNF-α极显著下降，说明该吸附剂对由泌乳牛体内多种霉菌毒素造成的机体免疫功能的损害有一定程度的改善。

4 结论

本试验表明，日粮中添加复合霉菌毒素吸附剂后奶牛乳中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素分别降低了13.36%、8.64%、3.75%，血清中分别降低20%、14.62%、13.88%。试验还显示复合霉菌毒素吸附剂组血清中IL-1、IL-6和TNF-α水平降低，从而使奶牛免疫功能有所改善。总之，通过在饲粮中添加复合霉菌毒素吸附剂既可以保证泌乳牛正常生产，又可以减少奶牛血液与乳中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及伏马毒素的蓄积，从而减少霉菌毒素对奶牛机体健康的影响，同时减少原料奶的霉菌毒素残留，改善人类食品安全。