王玉梅 褚光辉 付玉(通讯作者)
(昆明理工大学医学院 云南 昆明 650000)
阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病,临床表现为进行性认知障碍和神经精神异常,AD的病理学改变包括:神经细胞内的神经元纤维缠结和细胞外的β淀粉样蛋白沉积等[1-2]。阿尔茨海默病的病因尚未完全明了,其发病机制的研究一直是神经科学研究的热点。目前,Aβ假说[3]因其能够较好的符合病理学、实验以及临床流行病学研究结果而受到越来越多的认可。
针对Aβ假说,目前构建了多种实验动物模型。APP/PSl双转基因小鼠被认为是最能够模拟AD自然病理生理过程的动物模型[4]。转基因鼠价格较高,为节约成本并使本课题有充足的AD模型,我们使用APP/PSl双转基因纯合子雄鼠和野生型雌鼠进行繁殖,采用Vazyme公司的试剂盒快速提取鼠尾基因组,采用多引物多重PCR进行子代小鼠基因型鉴定,鉴定结果准确快速。具体方法及结果如下。
由南京模式动物研究所提供B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax双转基因小鼠阳性雄鼠10只,野生阴性雌鼠10只(5~6月龄)。雌雄分开每5只一组饲养于昆明理工大学实验动物中心SPF级饲养间。饲养期间遵照国家实验动物饲养和使用指南,饲养环境为温度(22±2)℃ ,湿度:50%~70%,光周期L:D=12h:12h,自由饮水和取食。雄鼠体重28~32g,雌鼠体重23~26g。
One Step Mouse Genetyping Kit试剂盒(Vazyme公司)。APP、PSl引物(上海生工)。Genecolour Ⅱ TM核酸染料(北京金博益)。PCR仪(Biometra公司),凝胶电泳成像系统(Bio-Rad公司),低速台式离心机(Sigma公司),电泳仪(Bio-Rad公司)。
实验动物购买后在实验室内饲养一月后进行实验。雄鼠与雌鼠一对一进行交配繁殖。子代小鼠出生28天后雌雄分笼饲养并打耳标进行标记。
1.4.1 鼠尾获取 小鼠出生28天后剪取尾尖2~3mm备用。
1.4.2 DNA提取 (1)根据样品数按每个样品2μl蛋白酶K+100μl缓冲液配制裂解液;(2)每个EP管加入100μl裂解液确保鼠尾完全浸入,混匀,55℃金属浴20min;孵育完成后95℃金属浴5min灭活蛋白酶K;(3)裂解产物振荡混匀,12000rpm,离心5min。取上清液,-20℃保存。
1.4.3 PCR扩增引物序列设计如下 APP(350bp)正 义 链:5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'; 反 义链:5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCC-3'。PSl(608bp)正 义 链:5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'; 反 义 链:5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'。GAPDH(224bp) 正义 链:5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3', 反 义 链:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'。PCR反应体系25uL,同时加入三对引物进行扩增。扩增条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火40s,72℃延伸30s,35个循环,72℃延伸7min。
PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳后进行光密度扫描,用凝胶成像分析系统进行观察分析。
初始繁殖笼10笼,淘汰无法生育,吃崽及不哺乳小鼠后剩余6笼为可繁殖笼。每笼平均约每月繁殖一窝,每次产仔4~6只。合笼3个月后子代小鼠存活状况及基因鉴定结果如表1所示。
表 合笼三个月后子代小鼠的总数及基因型
AD为APP/PSl双转基阳性鼠,WT为野生同窝阴性鼠。表中数据为合笼三个月后子代成活小鼠数量。
以鼠尾组织基因组DNA为模板,鉴定电泳结果如图。5只小鼠的三引物体系均扩增出约200bp的内参基因,其中2、4、5号3只小鼠同时扩增出约350bp和600bp左右的条带,与APP和PS1基因大小相符。对比APP和PS1双引物体系的扩增结果,说明在合适的PCR条件下三引物体系可以准确有效鉴定出APP/PSl双转基因子代小鼠的基因型。
图 APP/PSl双转基因小鼠基因型的多引物PCR鉴定结果
M为DL2501 DNA Marker,2、4、5是双转基因阳性鼠,1、3是双转基因阴性鼠。
本实验采用APP/PSl双转基因纯合子雄鼠与野生同窝阴性雌鼠交配繁殖,根据遗传规律后代有1/4的机率为阴性纯合子,所以在使用前必须进行基因型检测。目前大多采用单引物进行基因扩增,鉴定过程较长且耗费较多的DNA样本及试剂。该实验使用Vazyme公司One Step Mouse Genetyping Kit试剂盒快速提取组织DNA,且裂解产物经离心后不需其他处理即可直接用做PCR扩增模板。采用多对引物法同时进行PCR扩增的鉴定结果与双引物法相同,但极大的节省了实验时间,为课题组今后开展AD相关研究提供了理想的动物模型。