利用VIGS技术研究NtbHLH93基因在烟草甾醇代谢中的功能

武明珠，刘瑞霞，王 中，郑庆霞，张剑锋，李泽锋，谢小东，魏 攀，李 锋，罗朝鹏，曹培健，杨 军*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2.郑州师范学院，郑州市惠济区英才街6号 450044

转录因子bHLH（Basic/helix-loop-helix，碱性/螺旋-环-螺旋）广泛存在于生物体内，是真核生物中一类拥有众多成员的重要转录因子。bHLH转录因子的作用广泛，主要参与调控植物的生长发育、抗逆性、次生代谢过程［1-3］；参与调控动物的神经发育、肌肉发生、心脏发育等过程［4-5］；参与调控酵母的磷吸收和糖酵解过程［6］。

bHLH转录因子一般具有典型的螺旋-环-螺旋结构（Helix-loop-helix,HLH）。HLH区域大约由40个氨基酸组成，位于bHLH结构域的C端，含有既亲水又亲脂的α-螺旋（α-Helix）。两个α-螺旋之间被不同长度的连接区（Loop）分开，形成螺旋-环-螺旋结构。bHLH转录因子家族成员的碱性区域（Basic region）位于bHLH结构域的N端并与HLH基序相邻，由10～15个氨基酸组成，其中包括6个共有氨基酸残基，该区域主要与DNA结合。同一个bHLH转录因子的两个α-螺旋或不同bHLH转录因子α-螺旋之间可以相互作用，形成同源或异源二聚体，从而与靶基因启动子的不同部位结合，对基因的转录发挥调控作用［7］。

目前，拟南芥和水稻中分别预测到158个和173个bHLH转录因子，并且把bHLH基因家族分为26个亚类。Li等［8］发现在水稻和拟南芥中，有72个bHLH基因在根、茎、叶和花中都有表达。其中，10个在根部特异表达，1个在茎部特异表达，9个在叶片中特异表达，30个在花和种子中特异表达。bHLH转录因子普遍表达的特点与其广泛的生物学功能相对应。拟南芥AtbHLH93转录因子可以调控拟南芥在短日照情况下的生长发育和开花时间，GUS染色发现AtbHLH93基因主要在拟南芥幼苗的叶脉及根冠中表达［9］。Feldman 等［10］研究发现AtbHLH93还可调控拟南芥甾醇类和异戊二烯类物质的合成代谢，突变体bhlh93和野生型相比，突变体中甾醇类物质含量显著下降，其中豆甾醇的含量下降最多。

烟草中的甾醇类物质主要有胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等［11］，霉变烟叶中还可能含有麦角甾醇［12］。植物甾醇在一定温度下裂解均能产生稠环芳烃类化合物（PAHs）［13-14］。含有大量甾醇的烟草己烷萃取物是卷烟烟气PAHs的主要前体物，卷烟烟气中61%的苯并[a]芘（B[a]P）由它裂解产生［9］。豆甾醇在750℃下热解可以生成B[a]P［11,15］，在豆甾醇裂解过程中，可能甾醇骨架的一系列单分子反应后形成了菲、蒽等PAHs，而菲、蒽等PAHs的形成依赖于甾醇多环骨架［16-17］。PAHs是最早发现的具有“致癌、致畸、致基因突变”的有毒物质［18］。降低烟草中甾醇含量，可降低烟气中PAHs的含量。前期实验中克隆到栽培烟草红花大金元NtbHLH93基因，发现其与拟南芥AtbHLH93基因序列高度相似［19］。为此，对NtbHLH93基因的沉默植株进行分析，旨在解析NtbHLH93在烟草甾醇合成中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

本氏烟草（Nicotianabenthamiana）种子经10%NaClO消毒后，种植于MS培养基中。成苗期进行移栽后，种植于国家烟草基因研究中心温室。

Fast High Fidelity Polymerase高保真酶购于北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒、反转录试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD19-T载体均购于宝生物工程（大连）有限公司；连接试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；MS培养基购于美国Sigma-Aldrich公司；SYBR Premix Ex TaqTM购自宝生物工程（大连）有限公司。其他试剂均为国产分析纯。所用引物和产物的测序均由北京华大基因科技股份有限公司完成。

1.2 pTRV2重组载体的构建

根据NtbHLH93基因的全长序列，设计引物用于构建pTRV2重组载体。正向引物：5'-TACACCAT GGGAACATTGAATCGTCCAG-3'，反向引物：5'-TCA TGAGCTCCTCTTTGTAATTTCCCAG-3'。分别在两条引物上添加NcoⅠ和SacⅠ酶切位点和相应的保护碱基。PCR程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保温。PCR产物经酶切回收后连接到pTRV2空载体上，4℃过夜。连接载体转化感受态细胞DH5α后培养过夜，挑取白色单菌落，37℃摇床培养12 h（200 r/min）。以菌液为模板进行PCR，验证是否为阳性克隆。对含有目的片段的重组质粒进行双酶切验证和测序。

1.3 农杆菌的转化

农杆菌转化参照魏攀等［20］的方法。八氢番茄红素去饱和酶（PDS）基因为农杆菌侵染的报告基因。将 VIGS质粒pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS和pTRV2-NtbHLH93通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105中，经菌落PCR验证后，将阳性菌落接种到LB培养基中28℃过夜培养。LB培养基含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L利福霉素、20 μmol/L乙酰丁香酮（AS）及10 mmol/L 2-N-吗啉基乙磺酸（MES）。菌液4 000 r/min离心5 min后，弃上清液。用 10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS、10 mmol/L MES配制侵染缓冲液，再用侵染缓冲液重悬菌体，将菌液稀释至OD600为1.0左右。以本氏烟草为侵染对象，注射生理盐水的烟草为空白对照（Con），阴性和阳性对照分别为注射pTRV2和pTRV2-PDS质粒的农杆菌，实验组为注射pTRV2-NtbHLH93质粒的农杆菌。将含质粒pTRV1和pTRV2，pTRV1和pTRV2-PDS，pTRV1和pTRV2-NtbHLH93的农杆菌按1∶1的比例进行混合，用无菌注射器将农杆菌注入本氏烟草下部叶片中。

1.4 甾醇含量的测定

用GC-MS/MS检测转基因烟草中甾醇代谢物（胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等）含量的变化，每个样品3次生物学重复。样品前处理及分析：称取冻干烟叶样品50 mg，加1.5 mL正己烷、30 μL内标（10 ng/mL 5α-胆甾烷），涡旋6 s后室温超声提取20 min。将提取液静置15 min，6 000 r/min离心5 min。取500 μL上清液至1.5 mL进样瓶中，氮气吹干后加入50 μLN-三甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺（MSTFA）。在37℃下反应50 min后，进行GC-MS/MS分析。气相色谱条件：

色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样量：1.0 μL；分流比：10∶1；进样口温度：280 ℃；载气：He；流速：1 mL/min；升温程序：60 ℃（20 min）。离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；离子源：EI源；采集模式：选择离子监测（SRM）。

选择特征离子对甾醇化合物进行定量：根据鲜烟叶中主要甾醇化合物的结构特征离子，选择甾醇化合物的定量离子，分别对各种甾醇化合物进行定量分析，每个化合物同时选择2～3个离子碎片进行辅助定量。根据特征离子峰面积与内标峰面积比值进行绝对定量。

1.5 荧光定量PCR

根据NtbHLH93、Niben101Scf06249g03002.1和Niben101Scf06249g03002.1基因序列设计qPCR引物。NtbHLH93上游引物：5'-CACAGGTTGCGTGAA GATC-3'，下游引物：5'-GAGGGTTTCTGACAAGTG C-3'；Niben101Scf06249g03002.1上 游 引 物 ：5'-GGCACAGTCACCCACAAA-3'，下游引物：5'-ATCC CTTCGCCTGAACAT-3'；Niben101Scf06249g03002.1上游引物：5'-GCACCGTCACTCACAAAG-3'，下游引物：5'-CTGCTGCATCACCAACTA-3'。烟草26SrRNA为内参基因，上游引物：5'-GAAGAAGGTCCC AAGGGTTC-3'；下游引物：5'-TCTCCCTTTAACAC CAACGG-3'。用FluorescentQuantitativePCRDetector（美国BIO-RAD公司）进行qPCR。

在冰上配制20µL的反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 µL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 µL，30 ng/µL cDNA 1 µL，ddH2O 8 µL。进行3次独立生物学重复，以不加模板的反应为阴性对照。qPCR反应程序：预变性94℃30 s；94℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。反应结束后，根据得到的CT值，用 2-△△CT方法计算相对表达量［21］。经26S rRNA基因标准化后，设相同处理时间下对照的相对表达量为1，基因的相对表达量则为该基因与对照处理的比值。

1.6 转录组测序及数据分析

取VIGS诱导的基因沉默烟株和对照烟株（移栽4周后的本氏烟草，每个处理3个生物学重复）叶片，液氮速冻后，置于泡沫箱中用柱状干冰运输至金唯智生物科技（北京）有限公司，进行转录组测序。转录组数据经过简单拼接，用de novo生物信息学软件进行组装。组装后的数据使用NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和中国烟草基因组数据库（V3.0）进行比对分析，选取表达差异倍数≥2的基因。使用blast2 go软件进行GO功能分析。

1.7 数据处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，选择Duncan’s测验（P＜0.05）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 NtbHLH93基因的载体构建

根据已克隆到的NtbHLH93基因全长序列设计VIGS引物，并进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行验证，发现扩增条带长度在500 bp左右（图1a）。将PCR产物连接到PTRV2空载体上，对pTRV2-NtbHLH93重组载体进行双酶切，发现酶切产物长度在500 bp左右（图1b）。对重组质粒进行测序，发现插入片段的序列与NtbHLH93基因的编码序列一致。

2.2 农杆菌侵染结果

由图2可知，本氏烟草在注入pTRV2（阴性对照）农杆菌10 d后，其表型和空白对照（Con）没有明显差异。而注入pTRV2-PDS（阳性对照）农杆菌10 d后，新长出的叶片出现明显的白化症状，表明PDS基因被沉默，同时也表明农杆菌的侵染效率较高。pTRV2-NtbHLH93农杆菌侵染烟草后，烟株也出现明显的白化症状，说明NtbHLH93基因可能影响烟株中叶绿素的合成。

M1.Marker 2000 1,2.PCR扩增产物 M2.Marker 10 000 3,4.pTRV2-NtbHLH93重组载体双酶切产物 a.NtbHLH93基因的PCR电泳图 b.pTRV2-NtbHLH93重组载体双酶切的PCR电泳图

图2 农杆菌侵染本氏烟草10 d后的烟株表型Fig.2 Phenotype of tobacco seedlings on the 10th day after infection by Agrobacterium tumefaciens

2.3 农杆菌侵染后NtbHLH93基因的表达

接种两周后，选取6株被pTRV2-NtbHLH93农杆菌侵染烟草的上部叶用于检测NtbHLH93基因的表达。由图3可知，在空白对照（Con）和注射pTRV2空载体的烟株中，NtbHLH93基因的表达差异不显著。但是在注射pTRV2-NtbHLH93载体的烟株（R1～R6）中，NtbHLH93基因的表达量明显下降，与对照（Con）相比表达量平均降低46.3%。

2.4 NtbHLH93基因对甾醇含量的影响

图3NtbHLH93基因的qPCR检测结果Fig.3 qPCR result of NtbHLH93

表1 甾醇含量的测定①Tab.1 Determination of sterol content （μg·g-1）

测定了对照（Con）及注射pTRV2-NtbHLH93烟株（R4株系）中的总甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇及羊毛甾醇含量（表1），发现注射pTRV2-NtbHLH93烟株中的总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇含量明显下降。与对照（Con）相比，分别降低17.97%、21.48%、14.02%和9.09%。其他种类甾醇的含量没有明显变化。

2.5 NtbHLH93基因对烟草叶绿素合成的影响

下调NtbHLH93基因后，烟叶出现了明显的白化症状。转录组测序结果（表2）表明，在265个差异表达的基因中，有44个与叶绿素合成相关的基因下调表达：①与捕光色素蛋白复合体相关的基因有25个，其中，与捕光色素蛋白复合体Ⅰ相关的基因有9个，与捕光色素蛋白复合体Ⅱ相关的基因有16个；②与光合系统相关的基因有19个，其中，与光合系统Ⅰ相关的基因有11个，与光合系统Ⅱ相关的基因有8个。以上结果表明NtbHLH93基因不仅影响甾醇类物质的合成，还影响叶绿素的合成。

2.6GO分析

分析对照和NtbHLH93基因表达量下调烟株的转录组数据，发现一些与生物学过程、分子功能、细胞组分相关的差异表达基因。其中，与生物学过程相关的基因最多，分子功能次之，细胞组分最少（图4）。生物学过程中，与代谢过程及细胞过程相关的基因最多，分别占生物学过程总基因数量的62.5%和54.4%。分子功能中，与催化、结合及结构分子相关的基因最多，分别占分子功能总基因数量的22.4%、23.6%和21.2%。细胞过程中，与细胞、细胞组分、大分子复合物相关的基因最多，分别占细胞过程总基因数量的49.4%、49.4%和24.3%。

表2 pTRV2-NtbHLH93烟株中与叶绿素合成相关的差异表达基因Tab.2 Differentially expressed genes related to chlorophyll synthesis in pTRV2-NtbHLH93 tobacco seedlings

图4 差异表达基因的GO分析Fig.4 GO analysis of differentially expressed genes

2.7KEGG代谢通路分析

通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库来分析转录组数据中差异表达的基因，发现了一些基因参与萜类化合物的生物合成。在MEP（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸）代谢中，有2个基因（Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1）在NtbHLH93沉默植株（R4株系）中分别上调了2.67和2.95倍。进一步通过qPCR验证，发现与Con对照相比，这两个基因分别上升了3.81和4.23倍（图5）。Niben101Scf00063g13014.1和Niben101S cf06249g03002.1与GGPPS基因的序列高度相似，推测当甾醇合成通路受阻时，MEP代谢通路中的GGPPS基因表达上调。

图5 NtbHLH93下调对Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1表达的影响Fig.5 Effects of downregulated NtbHLH93 on Niben101Scf00063g13014.1 and Niben101Scf06249g03002.1 expressions

3 讨论

甾醇是卷烟烟气PAHs的主要前体物［9,11,15］。Feldman［10］发现拟南芥转录因子 bHLH93与甾醇及异戊二烯类物质的合成有关，与野生型相比，拟南芥bhlh93突变体中甾醇类物质含量显著下降。本研究中，利用VIGS技术下调烟草中NtbHLH93基因的表达后发现，总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低。在植物质体中，萜类物质的合成通过MEP代谢途径完成，而GGPPS基因是MEP代谢途径中的关键基因。由GGPPS催化合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate,GGPP）与甾醇合成途径共用两个前体物：异戊烯基二磷酸（Isopentenyldiphosphate,IPP）和二甲烯丙基二磷酸（Dimethylallyldiphosphate,DMAPP）［22］。本研究中，通过转录组分析发现在pTRV2-NtbHLH93烟株中，参与MEP代谢途径的Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g030 02.1表达量明显升高，这两个基因与GGPPS基因序列高度相似，推测GGPPS基因表达量的上升可能与bHLH93基因被抑制有关。此外，NtbHLH93基因表达下调后，烟草叶片发生了明显的白化。在拟南芥中过表达bHLH93基因后，植株叶片显著变绿，表明该基因还能影响叶绿素的生物合成［9］。

4 结论

①利用VIGS技术将烟草中已克隆到的NtbHL H93基因进行沉默，发现pTRV2-NtbHLH93烟株中NtbHLH93基因的表达量与对照植株相比平均降低了46.3%。②对pTRV2-NtbHLH93烟株中的甾醇含量进行测定，发现总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低，分别降低了17.97%、21.48%、14.02%和9.09%。③转录组分析发现在pTRV2-NtbHLH93烟株中，参与MEP代谢途径的Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g0300 2.1表达量明显升高，分别升高了2.67和2.95倍。