基于HPLC法测定不同产地黄芪总黄酮和异黄酮的含量

刘亚令，耿雅萍，黄小苏，赵琳儒，张鹏飞

(1.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801)

黄芪原名黄耆，始载于《神农本草经》，为豆科多年生草本植物蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge) Hsiao]或膜荚黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.]的干燥根[1,2]，主产于山西、内蒙古、河北、甘肃、陕西、黑龙江等地。黄芪具有补气健脾，益卫固表，利尿消肿，托毒生肌的功效，是传统大宗中药材之一[3]。现代医学研究表明，黄芪有增强免疫、促进造血、调节血糖、降血脂、促进蛋白质和核酸代谢、强心、保护心肌和调节血压等作用[4]。黄芪中的黄酮类化合物(包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素等)能够通过抑制内皮细胞氧化应激损伤、凋亡和炎症，保护血管内皮免受糖尿病损伤[5]，是黄芪的主要功能性化学成分。毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量被作为黄芪药材质量的控制标准之一，《中华人民共和国药典》(后文中简称为“药典”)规定了黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得少于0.020%”[1]。在黄芪功效不断被认可的同时，其消耗量与日俱增，巨大的需求量加剧了野生药材黄芪的采挖速度，使其面临濒危的局面，各道地产区、非道地产区均开始大量人工栽培黄芪。然而产地对中药材质量有重要的影响，不同产地的黄芪黄酮类、皂苷类、多糖类主要化学成分含量有较大的差异[6,7]，各地所产黄芪质量良莠不齐[8,9]，给药材的合理利用带来一定的影响。为更客观地评价黄芪的药材质量，本研究选取14个不同产区的16份黄芪样品，采用HPLC测定其总黄酮和毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素等4种异黄酮类含量，分析产区对药材质量的影响，以期为合理规划黄芪产区提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采集了山西、黑龙江、吉林、辽宁4个省14个产区的膜荚黄芪和蒙古黄芪共16份药材黄芪根作为试验材料(表1)，将采集到的样品根系干燥、粉碎，过60目筛，备用。

表1 黄芪药材来源Table 1 Origin of Radix Astragalus samples

1.2 仪器

色谱仪(UltiMate UltiMate 3000)，配有自动进样器、紫外检测器，FW135中草药粉碎机(天津斯泰特仪器有限公司)，WZS-20标准60目筛(淄博史克制药设备有限公司)，SHZ-DⅢ型循环水式多用真空泵(郑州市亚荣仪器有限公司)，IKAR10数显型旋转蒸发仪(德国IKA)，BSXT-02索氏提取器(上海鑫翁科学仪器有限公司)，JA2003电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，单列二孔仪表恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司)，超声波清洗器，台式离心机。

1.3 试药

标准品：芦丁(批号：MUST-16122011)、毛蕊异黄酮(批号：MUST-16120911)、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷(批号：MUST-16031205)、刺芒柄花苷(批号：MUST-16031111)、芒柄花黄素(批号：MUST-16031005)，均购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度大于98 %。色谱分析甲醇和乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，提取时甲醇为分析纯，水为蒸馏水。

1.4 色谱条件

总黄酮的色谱条件为：DIKMA Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长250 nm，流动相：乙腈-水(含0.5 %磷酸)梯度洗脱(表2)。

表2总黄酮流动相梯度洗脱程序

Table2Mobilephasegradientelutionprocedureoftotalflavonoids

时间/minTime乙腈比例/%Acetonitrile ratio水(0.5%磷酸)比例/%Water (0.5% phosphoric acid) ratio0208052080106535256535302080352080

4种异黄酮类的色谱条件为：色谱柱DIKMA Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长250 nm，流动相：乙腈-水(含0.5 %磷酸)梯度洗脱(表3)。

1.5 对照品溶液的制备

精密称取芦丁0.5 mg、毛蕊异黄酮1.52 mg、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷1.98 mg、芒柄花黄素0.22 mg、刺芒柄花苷标准品0.60 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得0.050 g·L-1芦丁，0.152 g·L-1毛蕊异黄酮，0.198 g·L-1毛蕊异黄酮葡萄糖苷，0.022 g·L-1芒柄花素，0.060 g·L-1芒柄花苷的对照品溶液。

表3异黄酮流动相梯度洗脱程序

Table3Mobilephasegradientelutionprocedureofisoflavones

时间/minTime 乙腈比例/%Acetonitrile ratio 水(0.5%磷酸)比例/%Water (0.5% phosphoric acid) ratio0208053565155050306535456535605050753565802080

1.6 样品溶液的制备

精密称取1.00 g药材黄芪粉末，包入纸袋后置于虹吸管中；加甲醇80 mL于平底烧瓶内，索氏提取1 ～ 2 h；真空抽滤，65 ℃减压回收至干；滴加适量甲醇溶解，将溶液移至2 mL容量瓶，定容，摇匀，即得供试品溶液。

1.7 数据分析

采用SAS 8.0软件的princomp过程进行主成分分析[10,11]，Prin1、Prin2分别代表第1主成分和第2主成分，以此类推；采用SPSS 23.0软件进行沃德连接的聚类分析；采用SIMCA-P 14.1软件进行主成分图谱的分析[12]。

2 结果与分析

2.1 高效液相图谱

在上述色谱条件(1.4)下，先用单一对照品确定不同组分的保留时间，再将毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素4种对照品混合后获得混合对照品的色谱图(图1)，峰1 ～ 4分别为毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素，以芦丁为对照品测定总黄酮含量，单测，峰5为芦丁。不同组份间分离明显，峰形好，可以用于成分的测定。

2.2 黄芪中总黄酮及4种异黄酮含量分析

测定结果显示，16份黄芪样品中的总黄酮及4种异黄酮含量均存在差异(表4)。样品中总黄酮含量在0.007%～0.362%之间，最高为辽宁新宾膜荚黄芪，最低为吉林新兴林场膜荚黄芪。毛蕊异黄酮苷含量在0.004%～0.040%之间，最高为山西广灵蒙古黄芪，其次分别为山西代县蒙古黄芪、辽宁新宾膜荚黄芪和山西浑源泽清岭蒙古黄芪和膜荚黄芪。这5个样本的毛蕊异黄酮苷含量高于其它地区，并符合药典中毛蕊异黄酮葡萄糖苷不得少于0.020 %的要求，另外11份黄芪样品均未达到药典标准。芒柄花苷含量在0.003%～0.073%之间，最高为山西代县蒙古黄芪，最低为黑龙江穆棱膜荚黄芪和浑源西泥沟蒙古黄芪。毛蕊异黄酮含量在0.002%～0.011%之间，最高为山西广灵蒙古黄芪，最低为山西阳高蒙古黄芪。芒柄花素含量在0.001%～0.008%之间，最高为山西浑源泽清岭膜荚黄芪，最低为山西广灵蒙古黄芪。将16个不同产地药材黄芪按基源分为膜荚黄芪与蒙古黄芪两组，用SAS分析软件进行方差分析结果显示，膜荚黄芪与蒙古黄芪中总黄酮和4种异黄酮含量在物种间的差异均未达到显著水平(P>0.05)。

图1 对照品液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography of reference solution注：1.毛蕊异黄酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊异黄酮；4.芒柄花素；5.芦丁Note: 1. Isoflavone glycoside; 2. Acanthophorum anthocyanin; 3. Isoflavone flavonoids; 4. Anthocyanins; 5.Rutin

2.3 主成分分析

2.3.1 不同产地药材黄芪成分的相关性分析

经SAS 8.0软件处理标准化的数据可得5个变量的相关系数矩阵(表5)，毛蕊异黄酮苷含量与芒柄花苷、毛蕊异黄酮、总黄酮含量显著相关(P<0.05)，芒柄花苷与毛蕊异黄酮显著相关(P<0.05)。从总体数据来看，50%的数据绝对值大于0.30，各变量两两之间显著相关(P<0.05)，可用主成分分析法来研究变量之间的关系。

2.3.2 不同产地药材黄芪的主成分分析

主成分由属性变量的线性组合构成，成分协差阵的特征根分析见表6。主成分1-3的特征值分别为2.643、1.026和0.717，方差贡献率达到52.866%、20.525%和14.339%，以方差贡献率及特征值>1综合考量确定主成分个数，则确定1和2两个主成分能对16个不同产地药材黄芪中总黄酮和4种异黄酮含量的信息进行概括分析。

通过对第1、2主成分的特征值及方差累计贡献率的计算可得主成分载荷矩阵(表7)。由表7可看出，第1个主成分中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及总黄酮的载荷系数较大，对第1个主成分的贡献较多(方差贡献率超过50%)，因此确定毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及总黄酮含量是衡量不同地区药材黄芪质量的重要因素。

2.3.3 不同产地药材黄芪的综合评价

由主成分载荷矩阵可以得到各主成分得分的计算公式，通过计算得不同产地药材黄芪的主成分综合得分及排名(表8)。从表8中可看出，主成分综合得分最高为山西代县，其次为山西广灵、山西浑源泽清岭的蒙古黄芪，可见产自这几个区域的药材黄芪质量最好，其它产区次之，其它产区的黄芪质量欠佳。

表4 不同产地黄芪总黄酮及4种异黄酮含量/%Table 4 Contents of total flavones and four isoflavones of Radix Astragaliin in different habitats

表5 成分相关矩阵Table 5 Component correlation matrix

注：“*”表示在0.05水平上显著相关，“**”表示在0.01水平上极显著相关。

Note: “*” significant correlation at level 0.05，“**” highly significant at level 0.01

表6 成分协差阵的特征根分析Table 6 Characteristic root analysis of component covariance matrix

表7 主成分载荷矩阵Table 7 Principal component load matrix

2.4 SIMCA-P 主成分分析

将不同产地药材黄芪的总黄酮及4种异黄酮含量设为特征变量值导入SIMCA-P 14.1软件，将数据标准化后进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，得到得分图(图2)、得分散点图(图3)和VIP图(图4)进行产地鉴别。图2和图3表明，按照不同产地得分可将药用黄芪聚为三类：10与16聚为一类，1、3、4、6、9、13、15聚为一类，其余聚为一类。从图4可看出，变量中的毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷得分大于1，在95%的置信区间内大于0，即在区分不同产地药材黄芪时具有显著的贡献率。

表8 不同产地黄芪主成分综合排名Table 8 Comprehensive ranking of principal component of Radix Astragaliin for different habitats

3 讨论与结论

不同研究者测定的黄芪总黄酮含量有一定的差异[6,13]，这可能与试验时所用的试材、提取方法、对照品和测定方法等有关。同时，黄芪中总黄酮含量与产地生态条件、生产工艺也有密切的关系，主要影响因子有土壤条件、温度、湿度、气候环境以及种植管理技术、采收时间、加工方法和生长年限等[14,15]，因此如何控制药材质量就显得十分重要。在《中国药典》中明确规定毛蕊异黄酮苷作为黄芪药材的主要成分之一，本试验发现并非所有产地的黄芪均能达到药典的要求，在本试验的16份样品中，只有5份样品达到药典要求，分别产自山西广灵、山西代县、辽宁新宾和山西浑源泽清岭4个地区(包括4份蒙古黄芪和1份膜荚黄芪)，也反映出山西黄芪的道地性。在达到药典标准的样品中，毛蕊异黄酮苷的含量也有差异，说明产地环境和栽培措施对药材质量有较大的影响。11个地区的药用黄芪的毛蕊异黄酮苷含量未达到药典中规定的不得少于0.020%的要求，反映了我国黄芪质量参差不齐，不容乐观的现状。各地在采集野生资源或者人工种植时应注意检测药材中毛蕊异黄酮苷的含量，只有达到药典要求的才能作为药材使用。同时要对不同批次药材进行抽样检测，以确定药材中有效成分的含量，在组方时才能更准确确定药材的使用量。

图2 不同产地黄芪主成分得分图Fig.2 Score of PCA of Radix Astragali from different habitats注：数字1～16代表药材黄芪不同产区，详见表1；绿点表示膜荚黄芪，蓝点表示蒙古黄芪Note: Figure 1～16 represents the different plance of Radix Astragaluss (detailed in table 1); The green dots represent the A.membranaceus and the blue dots represent the A.mongholicus

图3 不同产地黄芪主成分得分散点图Fig.3 Scattering points of principal components of Radix Astragali from different habitats

蒙古黄芪和膜荚黄芪中总黄酮和4种异黄酮类含量在不同种间的差异均未达到显著水平(P>0.05)，说明二者在主要功能成分含量上之间差异较小，这也是药典同时将这两个种作为基原药材的原因之一。

黄芪中异黄酮的种类主要有毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素，它们是黄芪具有抗氧化能力、清除自由基的主要活性成分。《中国药典》中只将异黄酮类中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量作为药材质量控制的指标，而随着中药现代化的发展，许多药材都以成分指纹图谱来控制中药的内在质量[5]。本试验可通过高效液相色谱法一次检测4种黄芪异黄酮的含量，方法简便快捷，可以此建立不同产地的4种异黄酮为基础的指纹图谱指标，合理的控制黄芪质量，提高中药质量的稳定性。

本试验中，主成分分析以特征值>1及方差累积贡献率确定主成分个数为2个，第1个主成分中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及总黄酮的载荷系数较大，对第1个主成分的贡献较多(方差贡献率超过50%)，是衡量不同地区药材黄芪质量的重要因素。经计算得出主成分综合得分最高为山西代县，其次为山西广灵及山西浑源泽清岭，均为蒙古黄芪，可看出山西代县的蒙古黄芪质量最好，且蒙古黄芪较膜荚黄芪占优势地位。从整体上看，原产山西的药材黄芪质量较优，符合其道地性。

图4 不同产地黄芪成分重要性差异图Fig.4 Difference map of component importance of Radix Astragalis from different habitats

SIMCA-P 主成分分析将16个不同地区的药用黄芪分为3类，除山西代县和山西广灵蒙古黄芪聚为一类外，其它2类中蒙古黄芪和膜荚黄芪均有，也说明蒙古黄芪和膜荚黄芪作为基原药材是可行的。在今后的试验中，要进一步探索各种生态条件及栽培措施等对黄芪药材主要功能成分如甲苷、多糖和类黄酮等的影响，加强规范化种植和道地产区区划建设，力求生产符合药典标准的高质量黄芪药材。