西藏绒山羊的微卫星多态性与部分经济性状的关联分析

德 吉，巴 贵，吴玉江，索朗达，袁 超，次仁德吉*

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009；

2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050）

微卫星（Microsatellite）是广泛分布于真核生物基因组中的简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），一般由2～6个碱基组成核心单元，重复类型分为单一型、复合型和间断型[2]。微卫星DNA符合孟德尔遗传模式，在真核生物基因组中广泛分布且数量庞大，具有分布均匀、多态性丰富、易于检测等特点[3]，作为优良遗传标记而广泛用于农作物和畜禽遗传育种领域[4-5]。张建军等对陇东绒山羊9个微卫星多态性进行分析表明所选的微卫星标记显示为高度多态，可用于遗传多样性评估[6]。张延虎等利用BM6438、BMS2782、BM1824等7个微卫星标记在南疆绒山羊群体中进行多态性分析，表明所选的微卫星标记均为高度多态，可以成为与经济相关的遗传标记[7]。古丽尼沙·吐拉甫等研究了9个微卫星在青格里绒山羊中的多态性，并与部分生产性能进行相关性分析，发现OarHH35、BM3033、BM1824、BMS1788可以作为青格里绒山羊细度或产绒量的分子标记[8]。

西藏绒山羊是我国绒肉兼用型地方品种，是我国的一大宝贵家畜品种资源，主要分布在西藏阿里地区日土县、那曲地区尼玛县等羌塘草原地区[1]，具有耐粗放、抗逆性强、羊绒细长柔软、产绒性能良好、品质优良、绒纤维细度在14μm左右等特点。目前，国内外对绵、山羊的微卫星标记研究报道较多，但对西藏绒山羊的研究还未见报道。本研究利用PCR-SSCP技术对西藏绒山羊10个微卫星进行多态性分析，对其多态性与其产绒量、细度、长度等产绒性状的关联性进行系统分析，为西藏绒山羊标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

颈静脉采集5 mL/只共计340份西藏自治区绒山羊保种场（阿里地区日土县、措勤县和尼玛县）成年绒山羊血液，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20℃保存。

体重、体长、绒长、产绒量等生产记录由各保种场提供。

1.2 主要仪器和试剂

PCR仪（ProFlexTMPCR）、离心机（Eppendorf 5424）、电泳槽（Mini-Protean Tetra Electrophoresis System）等。以上仪器及设备由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所动物育种实验室提供。

血液基因组DNA提取试剂盒（DP318-03）（购自天根生化科技＜北京＞有限公司）、Taq DNA聚合酶（购自大连宝生物工程有限公司）、其他常规试剂均为进口或国产分析纯级产品（购自兰州博乐知生物科技有限公司）。

1.3 血液基因组DNA提取

血液样品基因组DNA的提取参照天根血液基因组DNA提取试剂盒说明书。提取的基因组DNA通过核酸蛋白分析仪测定其浓度，于-20℃保存。

1.4 引物设计

根据微卫星选择标准，并参考前人研究结果，在Genbank中查找绵、山羊的微卫星标记，筛选出10个微卫星标记引物序列，见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used formicrosatellite amplification

1.5 PCR扩增

PCR反应体系为：Premix Taq 12.5μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L），DNA 1 μl（20 ng/μl），ddH2O 9.5 μl，共计 25 μl。

反应程序为：94℃预变性5 min；35个循环（94℃ 30 S，退火温度 30 S，72℃ 1 min）；72℃延伸10 min，4 ℃保存。

各PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 PCR-SSCP分析

取5μl的PCR产物在8%的非变性聚丙烯凝胶100 V电压条件下，4℃电泳4 h，银染法显色后拍照。

根据最终的成像胶图分析各微卫星全部个体的基因型。

1.7 数据处理及统计分析

应用 EXCEL软件计算基因型频率，并采用SPSS 20.0软件对西藏绒山羊不同个体基因型数据与部分经济性状数据（包括体长、体高、绒长、毛长等）相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 DNA提取

采用试剂盒法提取340份西藏绒山羊血液基因组DNA，提取的基因组DNA用1%琼脂糖胶进行完整性检测（图1），由图可见，条带清晰，均无拖带，符合分子生物学实验要求，用作后续试验。

2.2 PCR扩增

以西藏绒山羊血液基因组DNA为模板，用10对引物进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。由图1可知，PCR产物中均有清晰的DN A扩增条带大小为100～250 bp之间，扩增条带单一。

图1 部分基因组DNA琼脂糖电泳Fig.1 Part of genomic DNA agarose electrophoresis results

图2 微卫星BM S1248扩增产物Fig.2 Agarose electrophoresis results of PCR product ofmicrosatellite BMS1248

2.3 PCR-SSCP分析

对340份西藏绒山羊的10对微卫星扩增产物用8%非变性丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法判断等位基因的大小，部分结果见图3～4。10对微卫星引物除BM6438无多态性，其它都表现明显的多态性。通过带型进行基因分型，并统计基因型频率，结果见表2，9个微卫星位点基因型在5个以上，其中BMS1788位点有9个基因型。

2.4 9个微卫星位点多态性与生产性状关联分析

利用SPSS22.0统计软件对每个基因型与经济性状进行关联分析，其中基因型频率10%以下的不做分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，主要对体长、体高、胸围、羊绒长度、羊毛长度5项指标进行分析。由表3可见，在体长性状中，位点BM3033的基因型6显著高于其他基因型个体（P＜0.05），其他位点基因型间差异不显著（P＞0.05）；在体高性状中，位点BMS1248的基因型1和位点BM3033的基因型6显著高于其他基因型，其他位点基因型间差异不显著（P＞0.05）；在胸围性状中，位点BMS1248的基因型2和位点BM3033的基因型6显著高于其他基因型个体（P＜0.05），其他位点基因型间差异不显著（P＞0.05）；在绒长性状中，位点BMS1788的基因型3显著高于其他基因型个体（P＜0.05），其他位点基因型间差异不显著（P＞0.05）；在毛长性状中，位点BM3413的基因型1和基因型2显著高于其他基因型个体（P＜0.05），其他位点基因型间差异不显著（P＞0.05）；位点BMS1724、MCM38、BM6506、LSCV15、BMS2782 各基因型在体长、体高、胸围、绒长、毛长性状中差异不显著（P＞0.05）。

图3 微卫星BMS1248的部分PCR产物8%PAGE电泳检测Fig.3 Portion of 8%PAGE results of BMS1248

图4 微卫星BM 3033的部分PCR产物8%PAGE电泳检测Fig.4 Portion of8%PAGE results of BM3033

表2 9个微卫星位点的基因型特性Table 2 Genotypic characteristics of9 microsatellite loci

3 讨 论

目前采用微卫星标记进行畜禽选种育种辅助选择是速度最快、频率最高和可靠性最好的方法，可以在最短的时间内对群体中不期望出现的基因变异个体进行淘汰[9]。一般是先检测微卫星位点的多态性并进行基因型判定，然后利用数学统计方法对个体表型值和基因型的关联程度进行分析，最终找到和重要性状连锁的DNA标记。

古丽尼沙·吐拉甫选取17个微卫星位点在新疆山羊与青格里绒山羊进行多态性分析发现其中13个具有多态性且均为高度多态，与两个绒山羊群体经济性状进行关联分析发现MCM38的FH型、MCM38的FI型、MAF70的BF型和BMS1724的CC型可作为新疆山羊绒细度、绒长度、产绒量和含绒率的候选标记的优势基因型，LSCV15的BD型、BM3413

的CE型、BMS1788的DF型、BMS1248的BE型可望作为青格里绒山羊绒细度、绒长度、产绒量、含绒率的候选标记的优势基因型[10]。本研究选取了10个微卫星位点在西藏绒山羊进行多态性分析，其中BMS6438位点在西藏绒山羊中未发现多态性，与古丽尼沙·吐拉甫在新疆山羊与青格里绒山羊的多态性分析结果相同，说明BMS6438微卫星位点在这3个品种中不存在多态性，在其他品种是否存在，有待进一步研究。具有多态性的9个微卫星位点的基因型与西藏绒山羊部分经济性状的关联性分析发现，BM3033的基因型 6、BMS1248的基因型 1和BM3033的基因型 6、BMS1248的基因型 2和BM3033的基因型6、BMS1788的基因型3、BM3413的基因型1和基因型2可分别作为西藏绒山羊体长、体高、胸围、绒长、毛长的候选标记优势基因型。这与古丽尼沙·吐拉甫在新疆山羊的研究结果存在相似性，也有不同之处，导致出现不同结果的原因可能是采样本身、生产数据的测量、仪器设备等方面的原因，但从动物起源进化和分类角度分析，出现不同结果的主要原因是不同品种之间与生态环境因素的差异。

表3 微卫星位点的不同基因型与经济性状关联分析Table 3 Correlation analysis between different genotypes and economic traits ofmicrosatellite loci

本试验中选取了部分经济性状进行与微卫星基因型进行关联分析，初步得到的西藏绒山羊经济形状候选标记的优势基因型，为西藏绒山羊分子标记辅助选择提供参考依据。