响应面法优化青豆蛋白提取工艺

张悦，刘振春，彭雪，周瑾琨

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130000）

青豆（green bean）为豆科大豆属一年生草本植物，原产中国[1]。中国自古栽培，至今已有5000年的种植史。现在全国普遍种植，在东北、华北、陕、川及长江下游地区均有出产，以长江流域及西南栽培较多，以东北青豆质量最优。青豆中富含蛋白质和纤维素及多种抗氧化成分，还能消除炎症[2]。青豆可以为人体提供儿茶素以及表儿茶素两种类黄酮抗氧化剂，这两种物质能够有效去除体内自由基，预防由自由基引起的疾病，延缓身体衰老速度，还有消炎抗菌的作用。青豆蛋白是一种植物性蛋白质。青豆蛋白的氨基酸组成与牛奶蛋白质相近[3]，除蛋氨酸略低外，其他与动物蛋白质近，在基因结构上也是最接近人体氨基酸，所以是最具营养的植物蛋白质。青豆蛋白含量约为38%以上，是谷类食物的 4 倍～5 倍。FAO/WHO（1985）人类试验结果表明，青豆蛋白必需氨基酸组成较为适合人体需要，对于两岁以上的人，青豆蛋白的生理效价为100[4-6]。人体对蛋白质的需求因年龄、性别、体重、工种等不同而有所差异，为了指导人们的膳食，世界各国结合本国的情况分别制定出“推荐每日膳食营养素供给量”（recommended daily allowance，RDA）。1999年，美国食品药品监督局（Food and Drug Administration，FDA）发表声明：每天摄入25 g 克蛋白质，有减少患心脑血管疾病的风险[7]。

青豆具有降低血液中的胆固醇，及补肝养胃、滋阴强壮、有助于长筋骨、悦颜面、乌发明目、延年益寿等功效[8-9]。更年期妇女、糖尿病和心血管病患者最适宜吃青豆。青豆对脑力工作者和减肥者也非常合适[10]。现代人群所需要的食品应该是既能引起食欲，又无不良副作用，而且含有丰富营养。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青豆：吉林省舒兰市；青豆蛋白：吉林农业大学粮油实验室自提。

氢氧化钠、盐酸、石油醚、溴化钾、磷酸：北京化工厂；考马斯亮蓝G250：天津瑞金特化学品厂。

1.2 仪器与设备

FA1004A 电子天平、JY92-2ⅡDN 超声波细胞粉碎机：上海精天电子仪器有限公司；LXJ-ⅡB 冷冻离心机：宁波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9140ME数显鼓风干燥箱：上海安亭科学仪器厂；HH-2 数显恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DY-40电动粉末压片机：常州澳华仪器有限公司；PHS-3C 精密pH 计：天津市科器高新技术公司；FD-1 型冷冻干燥机：上海日岛科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 蛋白质等电点的测定

青豆蛋白的等电点测定，采用沉淀质量法：称取青豆粉（过 80 目筛）30 g，在 1∶20（g/mL）、45 ℃条件下，用 1 mol/L 的 NaOH 调节溶液 pH 值至 9.5，搅拌提取 30 min，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液，平均分成6 份，用1 mol/L HCl 调节溶液pH 值分别为4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，静置 1 h，5 000 r/min 离心 10 min，去除上清液，测定沉淀蛋白质的质量，从而确定其等电点。

1.3.3 碱溶酸沉法提取青豆蛋白

将干燥的青豆粉碎过80 目筛，称取5 g 青豆粉，按料液比为 1∶20（g/mL）搅拌 15 min，放入 45 ℃水浴锅中加热1 h，用1 mol/L 的NaOH 调节溶液pH 值为9.5，静置 15 min 后 5 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用1 mol/L 的HCl 调节溶液pH 值为4.4，静置30 min后5 000 r/min 离心10 min，取沉淀，冷冻干燥。

1.3.4 超声波辅助法提取青豆蛋白

将青豆粉按照料液比为 1∶20（g/mL）混合，超声功率500 W，超声30 min 后，按照1.3.1 试验方法进行操作。

1.3.5 超声波辅助法提取青豆蛋白单因素试验

根据预试验和文献[11-13]，固定其它因素考核某一因素的变化情况，进行以下单因素试验。

1.3.5.1 料液比对青豆蛋白提取率的影响

超声时间30 min、超声功率500 W。料液比分别取1∶18、1∶20、1∶22、1∶24、1∶26、1∶28、1∶30（g/mL），考察料液比对青豆蛋白提取率的影响。

1.3.5.2 超声时间对青豆蛋白得率的影响

料液比 1∶22（g/mL）、超声功率 500 W。超声时间取 10、20、30、40、50、60 min，考察超声时间对青豆蛋白提取率的影响。

1.3.5.3 超声功率对青豆蛋白得率的影响

料液比 1∶22（g/mL）、超声时间 30 min。超声功率取为 100、200、300、400、500、600、700 W，考察超声功率对青豆蛋白得率的影响。

1.3.6 响应面法优化试验

选取最佳方案，在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，选取3 个变量，采用响应面分析法对其进行优化，以得率为考察值，设计三因素三水平的响应面试验。试验因素与水平见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 The factors and level of response surface method

2 结果与分析

2.1 青豆蛋白最佳等电点的选择

不同pH 值条件下青豆蛋白沉淀的质量变化见图1。

图1 不同pH 值下蛋白得率的比较Fig.1 Comparison of protein yield at different pH values

在pH 值为9.5 时，以青豆蛋白质沉淀质量为指标，分别考察不同pH 值条件下青豆蛋白质沉淀的质量，在pH4.4 处青豆蛋白质沉淀最多，这主要是由于蛋白质肽键脱水缩合，某些氨基酸的残基电离，使得蛋白质分子所带的静电荷随溶液pH 值的变化而变化，根据等电点蛋白质溶解度最小的原理，测得青豆蛋白的等电点为pH 4.4，蛋白质所含氨基酸的种类和数量是特定的[14]。

2.2 超声波辅助法与碱溶酸沉法制备青豆蛋白提取率和纯度的比较

通过凯氏定氮法测定所提青豆蛋白的纯度，超声波辅助法提取青豆蛋白的得率为41.90 %，纯度为73.56%，碱溶酸沉法提取青豆蛋白得率为29.78%，纯度为86.42%，对比可得，在传统碱溶酸沉方法的基础上，利用超声波进行预处理，虽然超声波辅助法的纯度较传统方法略低，但提取率大大提高，说明超声波辅助法对青豆蛋白的提取有一定的优化作用。

2.3 预处理对青豆蛋白得率的影响

经过石油醚脱脂处理后青豆蛋白的得率为45.72 %，未经处理的青豆粉末，青豆蛋白的得率仅为37.85%，通过对比发现，这可能是因为青豆中含有的脂溶性物质影响了有效成分的溶出[15]，所以，提取前务必要对原料进行脱脂处理。

2.4 超声波辅助法提取青豆蛋白单因素试验结果

2.4.1 料液比对青豆蛋白得率的影响

料液比对青豆蛋白得率的影响见图2。

图2 料液比对青豆蛋白得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of green bean protein

由图2 可知，随着料液比的变化，蛋白质水解度呈现先上升后趋于平缓趋势，当料液比为1∶20（g/mL）时，青豆蛋白得率达到最大值，并逐渐趋于平缓只是因为随着溶液体积的增加，蛋白质的溶解度增大。但是当增加到一定程度，青豆蛋白得率不再发生变化，这可能是因为蒸馏水量过多导致青豆蛋白浓度过低[16]，因此体系的料液比为1∶20（g/mL）时所得的青豆蛋白得率最高，所以选择料液比为 1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）作为响应面的水平。

2.4.2 超声时间对青豆蛋白得率的影响

超声时间对青豆蛋白得率的影响见图3。

图3 对青豆蛋白得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on yield of green bean protein

由图3 可知，随超声时间的增加，青豆蛋白质分子在碱溶液中溶解度不断增加，最终到达一个平衡值，几乎不再发生变化，这是因为超声时间增加，蛋白质的溶出和扩散速度都不断增加，表现为青豆蛋白质分子在体系中的溶解不断增加，当时间大于30 min，整体处于平衡状态，体系组分不再溶出。因此，超声时间30 min 较为适宜。

2.4.3 超声功率对青豆蛋白得率的影响

超声功率对青豆蛋白得率的影响见图4。

图4 对青豆蛋白得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of green bean protein

如图4 所示，当料液比为 1∶20（g/mL），超声时间30 min，随超声功率增加，青豆蛋白得率逐渐增加，最好趋于平缓，这是由于超声功率增大，可产生强烈空化、微扰、界面等效应、从而提高了蛋白质分子的质量传递能力。当超声波强度达到或超过空化阀声压[17]，此时空化作用明显，青豆蛋白质得率增加，并且蛋白质溶出量远远超过其他杂质，表现为蛋白质得率增加[18]。因此，超声功率500 W 为适宜。

2.5 响应面法优化超声波辅助法提取青豆蛋白的工艺

2.5.1 响应面试验结果

用得率作为试验的响应值，根据单因素试验结果，选取对青豆蛋白得率影响较大的3 个因素，即超声时间（A）、超声功率（B）、料液比（C），利用 Box-Benhnken响应面分析法设计三因素三水平试验，结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 超声波辅助法提取青豆蛋白的响应面设计及试验结果Table 2 The response surface design and test results were obtained by ultrasonic method

表3 超声波辅助法提取青豆蛋白回归方程的方差分析Table 3 An analysis of the variance of the regression equation of green bean protein by ultrasonography

续表3 超声波辅助法提取青豆蛋白回归方程的方差分析Continue table 3 An analysis of the variance of the regression equation of green bean protein by ultrasonography

根据Box-Benhnke 中心组合设计原理，以青豆蛋白得率为响应值，利用Design-Expert8.06 对数据实施分析，经因素回归拟合，得到二次回归方程：

Y=45.13-0.27A-0.35B+0.11C+0.055AB+0.18AC+0.25BC-0.59A2-0.83B2-0.35C2

由表3 回归模型方差分析可得，此模型是极显著的（p＜0.001）。该回归模型的决定系数为 R2=0.989 9，校正决定系数 R2Adj=0.991 4，失拟项 p=0.364 1＞0.05，不显著，说明回归方程拟合程度良好，自变量与响应面之间线性关系显著，可用于青豆中蛋白提取效果的理论预测。模型中一次项 A、B、C，二次项 A2、B2、C2以及交互项AC、BC 表现为差异极显著，其余项差异均不显著。根据表3 可得3 个因素对蛋白得率的影响程度依次为：B＞A＞C，即超声功率＞超声时间＞料液比。

2.5.2 响应面及等高线分析

超声波辅助法提取青豆蛋白响应面及等高线分析见图5。

图5 各因素交互作用响应面及等高线图Fig.5 Interaction response surface and contour map of various factors

各因素之间的相互作用对青豆中提取出的青豆蛋白得率的影响可以由响应面及等高线反映出来。根据图6 可以得到，超声时间（B）对料液比（C）交互作用对青豆蛋白得率影响极显著，超声功率（A）对料液比（C）交互作用显著，超声功率（A）对超声时间（B）交互作用比较明显之外，剩下的交互项均不显著（影响不显著的交互作用响应面图未列出）。交互作用不显著可能是因素的主效应在起作用。曲线的走势越发明显的陡峭，说明对于青豆蛋白的得率此因素影响越大；曲线的走势越发平缓，表明青豆蛋白得率受此因素影响较小。研究结果表明，对青豆蛋白得率影响最大的是超声时间，其次是超声功率和液料比，这与表3 中回归分析结果是一致的。超声时间与超声功率对青豆蛋白得率的影响达到了极显著水平（p＜0.001），液料比对应的p 值小于0.05，达到了显著水平。

2.5.4 最佳制备条件的确定及验证

通过Design-Expert8.06 软件对回归方程的优化计算，并结合实际操作，得到以青豆以初始原料提取青豆蛋白的最佳条件为：料液比为1∶20（g/mL），超声功率为470 W，超声时间为27 min。按上述最佳条件进行3 次验证试验得到青豆蛋白平均得率为40.98%，纯度为73.65%，这与预测的青豆蛋白质得率41.90%十分接近，说明回归模型可以很好的反映提取青豆蛋白的最佳工艺。

2.6 提取物的鉴定

2.6.1 考马斯亮蓝试验

通过考马斯亮蓝试验得到结论，青豆蛋白提取物与考马斯亮蓝G-250 染色剂结合，产生变色反应，考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm 处，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595 nm 波长下有最大光吸收[19]。因此提取物中含有蛋白类化合物。

2.6.2 红外光谱检测

青豆蛋白红外光谱检测图见图6。

图6 红外光谱检测结果分析图Fig.6 Analysis diagram of infrared spectrum detection results

红外光谱检测结果如图6 所示，样品的红外光谱于3 306.22 cm-1的位置呈现宽而强的吸收峰，3 306.22 cm-1在 3 700 cm-1～3 300 cm-1范围内，是-OH 的伸缩峰，说明青豆提取物里面含有大量的酚羟基、醇羟基；于2 936 cm-1的位置呈现出弱的振动吸收峰，2 936 cm-1处于3 000 cm-1～2 700 cm-1之间，是C-H 键的伸缩振动峰，表明青豆提取物里面含有较少的饱和碳上的氢[20]；青豆提取物里面含有的官能团与蛋白质的标准品一致，因此可以确定提取物是蛋白质类化合物。

2.6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

青豆蛋白凝胶电泳分析图见图7。

图7 SDS-PAGE 电泳分析图Fig.7 SDS-page analysis chart

由图7 所示，青豆蛋白的SDS-PAGE 图谱可以清晰看出，青豆蛋白多以大分子的结构存在，其分子质量主要集中在50 kD～85 kD 之间，50 kD 分子量以下蛋白质亚基几乎不存在。可以确定为高分子蛋白质。

3 结论

本试验利用超声波辅助法提取青豆蛋白，以超声时间，超声功率，液料比为主要考虑因素，以青豆蛋白得率为响应值，通过Design-Expert 软件对青豆蛋白的提取工艺进行优化，确定了最佳提取工艺条件为：料液比 1∶20（g/mL），超声功率 470 W，超声时间 27 min，得到青豆蛋白得率为（41.90±0.43）%，纯度为73.56%，相较于传统的碱溶酸沉法提取蛋白质得率提高了12.22%。

通过单因素试验确定了豆渣膳食纤维的最佳提取工艺为：pH9.5，提取温度50 ℃，提取时间40 min。

对粗提物进行了凯氏定氮试验，考马斯亮蓝试验，红外光谱测定及SDS-PAGE 电泳分析，试验结果证明，该粗提物中含有蛋白质，并确定所提物质为青豆粗蛋白质。