基于响应面法优化的秘鲁鱿鱼肌肉嫩化工艺研究

魏婉莹，赵金丽，张小利，沈春蕾，张宾

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室，浙江舟山316022）

秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）又称巨型枪乌贼、美洲大鱿鱼，其体形巨大，全身肉质几乎均可食用，其也是资源最丰富的鱿鱼种类之一。秘鲁鱿鱼含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、微量元素及多不饱和脂肪酸等，兼具有预防贫血、降低胆固醇和甘油三酯含量、预防动脉粥样硬化和防止心血管疾病等功效，因此素有“穷人的鲍鱼”的美誉[1]。秘鲁鱿鱼营养价值及产量高、价格较低廉，也非常符合现代消费对营养的需求。但秘鲁鱿鱼的肌肉特性不同于鱼虾类等其它水产品，其肌肉中含有高达11%的不溶性肌基质蛋白，致使鱿鱼肌肉组织极其坚韧、干硬、不易被咬碎，受热后会变得更加紧密、纤维性增强，从而严重影响了老年人及婴幼儿等消费群体的食用性[2]。在一定程度下，较为坚韧的肌肉质构特性，制约了秘鲁鱿鱼产品的加工开发与利用[3]。因此，需对鱿鱼的肌肉质构进行改良，以提高秘鲁鱿鱼的加工利用价值及丰富其产品形式。

肌肉的嫩度是评价肉制品质量的首要指标，也是影响消费的重要因素。肉制品的嫩化处理是一种涉及生物、物理和化学的综合反应过程，肌肉中胶原蛋白的降解、肌原纤维的断裂，肌间和肌内联结蛋白的降解和内源酶活性调节都能对肌肉起到较好的嫩化作用[4-5]。肉的嫩化方法有生物嫩化法（外源酶、激素法等）、化学嫩化法（盐类、有机酸等）和机械嫩化法（电刺激等）等。其中，外源酶法嫩化，常采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、米曲蛋白酶等，通过适当断裂肌肉中结缔组织及肌纤维中的胶原蛋白、弹性蛋白等，从而提高肌肉组织的嫩度[6]。目前，已广泛应用牛肉、羊肉、鸡肉等养殖畜禽肉制品中[7-8]。但针对秘鲁鱿鱼肌肉组织的嫩化处理及相关加工制品开发，目前还较少[9]。本研究以资源丰富的秘鲁鱿鱼为原料，利用不同的蛋白酶对其肌肉组织进行嫩化，旨在改善鱿鱼肌肉嫩度，提高其口感，为高质量秘鲁鱿鱼制品的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻秘鲁鱿鱼，购于舟山市东河市场（体长15 cm～20 cm）。将冷冻鱿鱼体置于装有碎冰的泡沫箱内，45 min 内运回实验室。

菠萝蛋白酶（＞500 U/mg）：浙江玛雅试剂有限公司；木瓜蛋白酶（≥800 U/mg）、胰蛋白酶（≥250 U/mg）：上海瑞永生物科技有限公司。以上酶制剂纯度均＞98%。

MDF-U53V 型超低温冰箱：日本SANYO 公司；BS124S 型电子天平：德国赛多利斯公司；PHS-3C 酸度计：浙江纳德科学仪器有限公司；HWS-12 电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；TMS-Pro 物性测试仪：美国FTC 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验处理

冷冻秘鲁鱿鱼解冻（0 ℃～2 ℃，3 h）→去头皮及内脏，剖开胴体外套膜→胴体肌肉→纵切成3.0 cm～3.5 cm宽鱿鱼条→清水清洗→加入酶制剂溶液→水浴加热处理→部分样品冷却至室温（25 ℃）后测定指标→部分样品投入到100 ℃沸水中加热10 min→测定指标。

1.2.2 硬度及剪切力测定

采用TMS-Pro 物性测试仪，测定鱿鱼肌肉样品的硬度及剪切力[10]。硬度测定：采用TMS 不锈钢针头探针（直径1 mm），起始力0.6 N，测试速度60 mm/min。剪切力测定：采用不锈钢三角形剪切刀片（厚1.2 mm），起始力0.6 N，测试速度60 mm/min。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 酶制剂种类对鱿鱼肌肉嫩化效果的影响

以鱿鱼条：蒸馏水体积比为1∶3 的比例，将鱿鱼条置于蒸馏水中，蒸馏水中预先加入酶制剂（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或胰蛋白酶）浓度为200 U/100 mL，调节体系溶液pH 7.0，30 ℃水浴加热30 min。嫩化处理后，部分样品冷却至室温（25 ℃），测定（生）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力；部分样品继续投入至100 ℃沸水中，加热10 min 后取出冷却至25 ℃，测定（熟）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力。

1.2.3.2 酶制剂浓度对鱿鱼肌肉嫩化效果的影响

以鱿鱼条：蒸馏水体积比为1∶3 的比例，将鱿鱼条置于蒸馏水中，蒸馏水中预先加入菠萝蛋白酶浓度为 60、120、180、240、300 U/100 mL，调节溶液 pH 7.0，30 ℃水浴加热30 min。嫩化处理后，部分样品冷却至25 ℃，测定（生）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力；部分样品继续投入至100 ℃沸水中，加热10 min 后取出冷却至25 ℃，测定（熟）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力。

1.2.3.3 处理时间对鱿鱼肌肉嫩化效果的影响

以鱿鱼条：蒸馏水体积比为1∶3 的比例，将鱿鱼条置于蒸馏水中，蒸馏水中预先加入菠萝蛋白酶浓度为200 U/100 mL，调节溶液pH 7.0，30℃水浴加热15、25、35、45、55 min。嫩化处理后，部分样品冷却至 25 ℃，测定（生）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力；部分样品继续投入至100 ℃沸水中，加热10 min 后取出冷却至25 ℃，测定（熟）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力。

1.2.3.4 体系pH 值对鱿鱼肌肉嫩化效果的影响

以鱿鱼条：蒸馏水体积比为1∶3 的比例，将鱿鱼条置于蒸馏水中，蒸馏水中预先加入菠萝蛋白酶浓度为 200 U/100 mL，调节溶液 pH 值为 5、6、7 和 8，30 ℃水浴加热30 min。嫩化处理后，部分样品冷却至25 ℃，测定（生）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力；部分样品继续投入至100 ℃沸水中，加热10 min 后取出冷却至25 ℃，测定（熟）鱿鱼肌肉的硬度及剪切力。

1.2.4 响应面法优化设计

通过以上酶制剂种类筛选试验发现，菠萝蛋白酶对鱿鱼肌肉组织嫩化效果最佳。综合单因素试验结果，进而采用Box-Behnken 中心组合设计，以菠萝蛋白酶浓度（A）、处理时间（B）及酶溶液 pH 值（C）3 个影响因素，以鱿鱼肌肉硬度（Y1）和鱿鱼剪切力（Y2）为响应值，进行响应面分析优化试验。

1.2.5 数据分析

采用 Origin 8.0、SPSS 13.0 及 Design Expert 8.0 进行处理，试验数据均为3 次平行试验的平均值，结果表示为平均值±标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 酶制剂种类对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响

肌肉制品的嫩化常用外源蛋白酶进行酶解处理，具体如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶、枯草蛋白酶等，通过对肌肉中的结缔组织、肌纤维中胶原蛋白、弹性蛋白进行适当降解，在一定程度上破坏肌肉组织结构，从而提高肌肉的嫩度及感官品质[11]。本研究中，酶制剂种类对鱿鱼肌肉嫩化效果的单因素筛选试验，如图1、图2 所示。

图1 不同酶制剂对生鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.1 Effects of different enzymes on the hardness and shearing force of raw squid muscle

图2 不同酶制剂对熟鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.2 Effects of different enzymes on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

结果发现，菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对鱿鱼肌肉组织的硬度值，3 个处理组间未产生显著性差异（P ＞0.05）。对于生鱿鱼肌肉样品，相比于菠萝蛋白酶和胰蛋白酶处理，木瓜蛋白酶对鱿鱼肌肉组织剪切特性的嫩化效果最佳，嫩化后肌肉组织的剪切力值为12.24 N，显著低于菠萝蛋白酶（14.38 N）和胰蛋白酶（13.57 N）处理效果（P ＜0.05）。鱿鱼肌肉经100 ℃加热制熟后，菠萝蛋白酶的嫩化效果显著优于另两种酶，其肌肉剪切力值为12.30 N，显著低于木瓜蛋白酶（15.73 N）和胰蛋白酶（13.63 N）（P ＜ 0.05）。生鱿鱼肌肉表皮由坚韧的胶原纤维蛋白形成的网络结构组成，其肌肉硬度和剪切力值相对较高些。经蛋白酶酶解后，由于蛋白质的部分降解作用，致使组织质构特性有所降低，肌肉嫩度特性得以改善。经水浴加热后，鱿鱼肌肉中蛋白质发生了变性作用，而使得肌肉质构特性发生变化。在整个过程中，可能由于蛋白酶种类、处理方式及鱿鱼品种的不同，致使生、熟制鱿鱼质构特性有所不同[12]，其具体影响机制仍需进一步研究。本研究中，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对鱿鱼肌肉的嫩化效果相对较差些，可能是由于其在鱿鱼肌肉组织中较难以扩散，导致其对肌原纤维蛋白的酶解作用不能成分发挥[5]。此外，考虑到实际加工及消费过程，鱿鱼熟制品的嫩度（即剪切性能）对产品价值及消费者的可接受度影响最大，因而选择菠萝蛋白酶进行后续的嫩化试验研究。

2.1.2 菠萝蛋白酶浓度对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响

菠萝蛋白酶作为一种半胱氨酸蛋白水解酶，具有较强的蛋白质、肽、脂和酰胺水解能力，优先水解碱性氨基酸、芳香族氨基酸羧基一侧的肽链，应用于畜禽肌肉的嫩化过程，可显著提高肉制品的适口性[13]。不同菠萝蛋白酶浓度对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响，如图3、图4 所示。

图3 不同菠萝蛋白酶浓度对生鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.3 Effects of different bromelain concentrations on the hardness and shearing force of raw squid muscle

图4 不同菠萝蛋白酶浓度对熟鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.4 Effects of different bromelain concentrations on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

随菠萝蛋白酶浓度增加，生鱿鱼肌肉硬度和剪切力均呈现先下降后上升趋势。当菠萝蛋白酶添加浓度为180 U/100mL时，鱿鱼肌肉硬度和剪切力均达到最低，分别为1.86 N 和11.5 N。当菠萝蛋白酶浓度较高时（240 U/100 mL～300 U/100 mL），鱿鱼肌肉硬度和剪切力值再次升高，其原因可能是由于添加菠萝蛋白酶的酶解作用过度，鱿鱼肌肉肌纤维断裂、组织结构破坏而致使脱水严重，导致肌肉硬度和剪切力再次上升[14]。经熟制后的鱿鱼肌肉，硬度和剪切力未呈现明显变化趋势；当菠萝蛋白酶浓度为180 U/100mL时，肌肉硬度和剪切力达到最低（2.34 N 和10.08 N）。由上，选择菠萝蛋白酶浓度为180 U/100mL进行后面的试验。

2.1.3 嫩化时间对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响

不同嫩化时间对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响，如图5、图6 所示。

图5 不同嫩化时间对生鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.5 Effects of different tenderization time on the hardness and shearing force of raw squid muscle

图6 不同嫩化时间对熟鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.6 Effects of different tenderization time on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

从图中可看出，嫩化时间对于肌肉组织的硬度值未产生显著性影响（P ＞0.05）。对于未经熟制的生鱿鱼，嫩化加热35 min 时，肌肉组织剪切力达到最低为10.58 N，显著低于其它加热嫩滑处理时间。经过熟制后鱿鱼，肌肉组织剪切力未呈现明显的变化趋势，但仍可发现在嫩化处理35 min 时，肌肉组织硬度和剪切力均较低（2.1 N 和12.26 N）。由上，当嫩化时间过短时（＜35 min），鱿鱼肌肉硬度和剪切力值均不理想，其原因是菠萝蛋白酶未能充分发挥其水解作用，组织嫩化效果不佳[15]。当嫩化时间过长（＞45 min），菠萝蛋白酶的水解作用时间长，会造成肌肉酶解过度，同时肌肉的保水能力也大幅降低，反过来影响了肌肉的硬度和剪切特性[16]。因此，选择嫩化处理时间为35 min 开展后面的试验。

2.1.4 体系pH 值对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响

不同体系pH 值对鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响，如图7、图8 所示。

图7 不同体系pH 值对生鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.7 Effects of different system pH values on the hardness and shearing force of raw squid muscle

图8 不同体系pH 值对熟鱿鱼肌肉硬度和剪切力的影响Fig.8 Effects of different system pH values on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

结果发现，随着体系pH 值的增大，生、熟制鱿鱼肌肉硬度和剪切力值，均呈现先下降后上升趋势。当嫩化体系pH 值为7 时，生、熟制鱿鱼肌肉硬度和剪切力值均达到最低，尤其肌肉剪切力值均显著低于其它处理组（P ＜0.05），原因是菠萝蛋白酶此时处于较佳的活性状态，有利于将鱿鱼肌肉中的胶原蛋白分解，进而提高肉的嫩度[17]。因此，选择嫩化溶液体系pH 值为7 开展后续试验。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 影响因素选取及设计

根据单因素试验结果，选取对熟制鱿鱼肌肉剪切力具有显著影响的3 因素，即菠萝蛋白酶浓度、嫩化时间和嫩化溶液pH 值，以鱿鱼肌肉硬度和剪切力值为响应值，进行三因素三水平Box-Behnken 中心组合试验设计。试验影响因素设计及响应面分析结果，如表1、表2 所示。

2.2.1.1 各因素对鱿鱼肌肉硬度的影响

依据表2 数据，进行回归拟合分析，得到鱿鱼肌肉硬度与各因素变量的二次多元回归模型：

Y1=1.18-0.22A+8.75B+0.03C+0.15AB-0.092AC+7.5BC+0.78A2+0.014B2-0.29C2

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 响应面分析结果Table 2 The results of response surface methodology

对该模型进行方差分析，结果如表3。

表3 试验结果方差分析表（硬度）Table 3 Variance analysis table of test results（hardness）

续表3 试验结果方差分析表（硬度）Continue table 3 Variance analysis table of test results（hardness）

从表3 可知，该模型极显著（Pr＞F 值＜0.01），A、C、A2、C2在该模型中为显著变量，AB 的交互作用为极显著（Pr＞F 值＜0.01）。回归决定系数 R2=0.998 3，说明响应值的变化有99.83%来源于所选因素的变化。模型修正决定系数R2Adj=0.996 0，说明该模型能解释99.60%响应值的变化。失拟项不显著（Pr＞F＞0.05），可知方程对试验拟合度较好。

2.2.1.2 各因素对鱿鱼肌肉剪切力的影响

依据表2 数据，进行回归拟合分析，得到鱿鱼肌肉剪切力与各因素变量的二次多元回归模型：

Y2=2.56+0.62A-0.47B+0.21C-0.32AB+0.55AC+0.99BC+4.37A2+1.64B2+2.78C2

对该模型进行方差分析，结果如表4。

表4 试验结果方差分析表（剪切力）Table 4 Variance analysis table of test results（shearing force）

从表4 可知，该模型极显著（Pr＞F 值＜0.01），A、B、C、A2、B2、C2在该模型中为显著变量，BC 的交互作用极为显著（Pr＞F 值＜0.01）。回归决定系数 R2=0.998 4，说明响应值的变化有99.84%来源于所选因素的变化。模型修正决定系数R2Adj=0.996 2，说明该模型能解释99.62%响应值的变化。失拟项不显著（Pr＞F＞0.05），可知方程对试验拟合度较好。

2.2.2 响应面法作图分析结果

2.2.2.1 响应面法对熟鱿鱼肌肉硬度的分析结果

两因素交互作用对鱿鱼肌肉硬度影响的响应面图，如图9 所示。

图9 两因素交互作用对熟鱿鱼肌肉硬度影响的响应面图Fig.9 Response surface diagram of the interaction of two factors on the hardness of cooked squid muscle

图9（a）为菠萝蛋白酶浓度和嫩化时间对硬度的影响，从图中看出二者交互作用较好，显示不论菠萝蛋白酶浓度如何变化，嫩化时间的改变对鱿鱼硬度的影响很弱。图9（b）显示菠萝蛋白酶浓度和pH 值二者交互作用较好，随着菠萝蛋白酶浓度增加，硬度变化较快。图9（c）表明当嫩化时间固定时，随着pH 值增加，硬度几乎呈现线性变化。

2.2.2.2 响应面法对熟鱿鱼肌肉剪切力的分析结果

两因素交互作用对鱿鱼剪切力影响的响应面图，如图10 所示。

图10 两因素交互作用对熟鱿鱼肌肉剪切力影响的响应面图Fig.10 Response surface diagram of the interaction of two factors on the shear force of cooked squid muscle

图10（a）为菠萝蛋白酶浓度和嫩化时间对剪切力的影响，从图中看出二者其中一个变量固定时，另一个均呈现抛物线形状，先下降后上升。图10（b）显示随着菠萝蛋白酶浓度和pH 值升高，剪切力均先下降后上升。图10（c）显示随着菠萝蛋白酶浓度和pH 值升高，剪切力均先下降后上升。

2.2.3 验证性试验及结果

新鲜生鱿鱼受热后，肌肉组织更加紧密坚韧、纤维性更强及不易被咬断，致使消费者食用口感较差，尤其严重影响老年人及儿童等消费群体的食用可接受性。本试验主要通过蛋白酶嫩化处理以改善消费者的产品食用口感（主要考虑牙齿切断鱿鱼肌肉的特性），因而选择以剪切力为主要评价指标，经响应面优化获得最佳处理工艺。以肌肉剪切力为评价指标，得到秘鲁鱿鱼肌肉嫩化效果最佳工艺为：菠萝蛋白酶浓度213.25 U/100 mL，嫩化时间39.51 min，溶液pH 5.92。考虑到实际操作便利，最终确定菠萝蛋白酶浓度210 U/100 mL，嫩化时间40 min，溶液pH 6.0。在此条件下，进行了3 组嫩化处理平行试验，最后测得熟鱿鱼硬度为0.97 N，剪切力为2.98 N，与理论值硬度1.12 N，剪切力2.80 N 基本相符。

3 结论

以秘鲁鱿鱼肌肉为对象，利用单因素试验、中心组合Box-Behnken 试验设计及响应面分析，对秘鲁鱿鱼肌肉嫩化工艺进行了优化研究，获得最佳嫩化工艺为：菠萝蛋白酶浓度210 U/100 mL，嫩化时间40 min，溶液pH 6.0，此时测得熟鱿鱼硬度为0.97 N，剪切力为2.98 N，与建立模型的理论预测值基本相符。本研究选用菠萝蛋白酶为嫩化剂，通过响应面法优化获得一种鱿鱼肌肉嫩化工艺，可显著改善秘鲁鱿鱼肌肉的质构特性。该工艺技术操作较为方便、经济，可作为新型鱿鱼制品的加工开发奠定技术基础。