HPLC法同时测定蓝花参中芦丁、橙皮苷及槲皮素的含量

1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2.福建卫生职业技术学院，福建 福州 350101 3.福建卫生职业技术学院附属福建省级机关医院，福建 福州 350003

蓝花参[Wahlenbergiamarginata(Thunb.) A. DC.]为桔梗科蓝花参属的植物，以根或全草入药，具有益气健脾，祛痰止咳等功效，临床上常用于治疗感冒、气管炎、痢疾、百日咳[1]等疾病。药理学研究显示：蓝花参具有止咳化痰、消炎镇痛、保肝护胃及其改善胰岛素抵抗的药理作用[2-8]。目前已知蓝花参中化学成分包括甾体类、多炔类、挥发油、苯丙素类、黄酮类及萜类化合物[4,9-16]。其中周向文[4]从蓝花参醇提取物中分离出单体化合物，后经过波谱学分析并鉴定单体化合物8个，其中五个化合物为黄酮类，包括farobin B、异牡荆素、芦丁、3′-甲氧基-5,7-二羟基黄酮-6-C-波伊文糖-4′-O-葡糖糖苷和异牡荆素2′′-O-鼠李糖苷。而课题组的前期研究工作则首次采用液质联用技术对蓝花参进行分析，初步鉴定了蓝花参中的6个化学成分，均为黄酮类，分别是紫云英苷、芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜苷[15-16]，说明黄酮类成分为蓝花参主要成分之一。鉴于多指标综合评价药材质量能在一定程度能更全面且准确的对药材进行质量控制，课题组建立HPLC法同时测定蓝花参中芦丁、橙皮苷及槲皮素含量方案，为蓝花参的资源开发及质量控制提供参考依据。

1 实验材料

1.1 仪器 戴安U3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)； SinoChrom ODS-BP色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；SB4200DT超声波提取器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药 蓝花参全草干品(批号：14010507，福州回春中药饮片厂有限公司)经福建卫生职业技术学院药学系朱扶蓉副教授鉴定为[Wahlenbergiamarginata(Thunb.) A.DC.]。芦丁对照品(批号：100080-201610)、槲皮素对照品(批号：100081-201509)、橙皮苷对照品(批号：110721-201115)购于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 流动相乙腈(A)-0.5%乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5 min，10%～15%A；5～10 min，15%～17%A；10～20 min，17%～20%A；20～30 min，20%～20%A；30～40 min，20%～30%A；40～45 min，30%～40%A；45～55 min，40%～60%A；55～60 min，60%～10%A；60～65 min，10%～10%A)；流速：1 mL/min；检测波长268 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL，见图1。

2.2 对照品溶液制备 精密称定芦丁标准品9.620 mg、橙皮苷标准品10.36 mg、槲皮素标准品10.20 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度，得到浓度分别为0.9620、1.036、1.020 mg/mL的对照品贮备液。精密吸取各对照品贮备液适量于同一量瓶中，甲醇稀释得混合对照品溶液(浓度分别为19.24、41.44、10.20 μg/mL)。

2.3 供试品溶液制备 精密称定蓝花参药材约2.0 g，加入40%乙醇50 mL，精密称定，超声30 min，取出，放至室温，补足重量，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 标准曲线制备 分别精密量取芦丁、橙皮苷、槲皮素标准品溶液适量，稀释成一系列各标准品溶液，按2.1项下色谱条件测定，以各对照品溶液浓度(C)为横坐标x，峰面积(A)为纵坐标y，得回归方程。芦丁：y=0.128x+0.279(r=0.9970)，线性范围为3.848～48.10 μg/mL；橙皮苷：y=0.101x+0.401(r=0.9965)，线性范围为4.144～82.88 μg/mL；槲皮素：y=0.097x+0.007(r=0.9990)，线性范围为1.02～6.12 μg/mL。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件连续进样6次。芦丁、橙皮苷、槲皮素峰面积RSD分别为0.19%，0.37%，0.50%，表明该仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称定蓝花参药材约2.0 g，按2.3项下制备供试品溶液，于0、1.5、3，6、9、12 h，按2.1项下色谱条件进样。芦丁、橙皮苷、槲皮素峰面积RSD分别为0.61%、0.51%、1.54%，说明该供试品在12 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 精密称定蓝花参药材约2.0 g共6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。芦丁的平均含量为511.418 μg/g，RSD为0.59%；橙皮苷的平均含量为698.209 μg/g，RSD为0.47%；槲皮素的平均含量为118.184 μg/g，RSD为0.76%。说明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取同批蓝花参药材6份，每份1.0 g，均精密加入芦丁、橙皮苷、槲皮素混合对照品溶液适量，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样。芦丁、橙皮苷、槲皮素的平均加样回收率分别为99.68%、97.63%、98.71%，RSD分别为1.61%、1.39%、1.45%。说明该方法准确性高,见表1至表3。

表1 芦丁加样回收率试验结果

表2 橙皮苷加样回收率试验结果

表3 槲皮素加样回收率试验结果

2.9 样品测定 精密称取蓝花参2 g，按照上述实验条件平行测定三份。实验结果：芦丁、橙皮苷、槲皮素含量的平均提取量分别为480.243、780.552、132.469 μg/g，三次验证试验的RSD分别为0.81%、0.62%、1.2%。

3 讨论

由于乙醇对黄酮类成分的溶解性高[17]，有助于有效成分的提取，故本次实验采用乙醇作为溶媒对蓝花参中的黄酮类成分进行提取。通过查阅文献发现，甲醇-0.03%甲酸水、乙腈-0.2%乙酸水、甲醇-0.1%甲酸水均可作为同时测量芦丁、橙皮苷及槲皮素含量的流动相。故实验中考察了上述流动相条件，通过对比发现乙腈-0.2%乙酸水的色谱峰分离度及峰形相对较好，对洗脱条件进一步优化，最终选择乙腈-0.5%乙酸水梯度洗脱。

课题组前期对蓝花参提取条件进行考察，考察内容包括乙醇浓度、提取时间和料液比3个参数，结果显示：用40%乙醇在料液比为1∶25的条件下超声30 min，蓝花参中化学成分提取效果最优，所以本文对蓝花参提取采用该参数进行供试品溶液制备。

查阅文献可知，部分中药材的黄酮类成分具有止咳化痰的作用[18-21]，与蓝花参的用法功效不谋而合，课题的前期药理学研究也说明蓝花参在止咳化痰方面具有良好效果[22]，在本次实验基础上，下一步拟探讨已知化学成分与药效之间关系，为阐明蓝花参止咳化痰药效物质基础研究奠定依据。