蛴螬多糖的一般药理学及亚急性毒性研究

3

1.西北农林科技大学化学与药学院药学系，陕西 杨凌 712100；2.空军军医大学药学院药理学教研室，陕西 西安 710032；3.国家中医药管理局中药胃肠药理重点研究室，陕西 西安 710032

中药蛴螬是朝鲜黑金龟子(HolotrichiadiomphaliaBates)及同属近缘昆虫的干燥幼虫，是较为常用的动物药[1]。蛴螬首次收载于《神农本草经》：“味咸微温。主恶血、血瘀(《御览》作血瘴)，痹气，破折、血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤，青翳白膜。”其后历代典籍如《名医别录》《金匮要略》《证类本草》《本草纲目》等多有收载[2]，如《名医别录》曰：“生河内人家积粪草中。取无时，反行者良。”《证类本草》云：“味咸，微温、微寒，有毒。主恶血，血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤，青翳白膜，疗吐血在胸腹不去及破骨折，血结，金疮内塞，产后中寒，下乳汁。”《本草纲目》中记载：“蛴螬，释名地蚕、乳齐、应条，气味咸，微温，有毒。”蛴螬有破血逐淤，明目退翳的功效，可用于折损瘀痛、破伤风、喉痹、目翳等病症[3]。现代药理研究表明该药具有抗肿瘤、保肝、治疗口疮等多种生物活性[4-7]。近些年随着研究的深入，蛴螬的化学成分不断得到阐明，现已发现脂肪酸[8-9](油酸、棕榈酸、棕榈油酸等)、氨基酸(谷氨酸、甘氨酸等)、糖类(多糖)、矿物元素(钙、镁、铬等)、维生素(维生素A、维生素B)等[10]。同时，越来越多的研究证实蛴螬多糖是一种新活性成分，具有抗肿瘤、调节免疫、降血脂等多种作用，是蛴螬的药效活性成分之一。但是，蛴螬多糖的其它作用还有待于进一步发掘，毒副作用的研究目前也尚未见国内外文献报道。为此，本研究对蛴螬多糖一般药理作用，包括其对心血管系统、呼吸系统、神经系统的影响进行了系统评价，同时对其亚急性毒性也进行了初步探讨，旨在为蛴螬物效基础研究及蛴螬多糖的进一步开发提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 BP-2010A型无创血压分析仪和BPEditU数据处理系统(北京软隆)；D3024R型台式高速冷冻离心机(北京大龙)；Chemray 240全自动生化分析仪(深圳雷杜)；IX73倒置显微镜(奥林巴斯)；LT502T型电子秤(常熟市天量仪器有限责任公司)，AX224ZH/E分析天平(奥豪斯)；自制旷野箱(无盖纸箱55cm×40 cm×30 cm，格子数6 × 10)。

蛴螬多糖由本实验室制备[1]。地西泮(山东信谊制药有限公司)；戊巴比妥钠(美国英杰生命技术有限公司)，盐酸氯丙嗪注射液(上海禾丰制药有限公司)；生理盐水(陕西圣奥动物药业有限公司)。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、直接胆红素(D-BIL)、总胆红素(T-BIL)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、糖化血清蛋白(GSP)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、血清总胆汁酸(TBA)、碱性磷酸酶(ALP)、尿酸(UA)、血清乳酸脱氢酶同工酶(LDHi)、血清乳酸脱氢酶L(LDH-L)、肌酸激酶(CK)、肌酐(CRE)试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 实验动物 BALB/c小鼠，雌雄各半，18～22 g；SD大鼠，雌雄各半，180～250 g，购于第四军医大学实验动物中心，生产合格证号：SCXK(军)字第2007-007号。

1.3 一般药理学评价给药剂量与方法 按照一般药理学研究的药物剂量设置原则，以药效学有效剂量为一般药理研究的低剂量，高剂量设置为不产生严重毒性反应的剂量，两者取平均值设为中剂量。则小鼠蛴螬多糖低、中、高剂量依次为50、225、400 mg/kg；根据大鼠、小鼠与人的给药换算比例，大鼠给药低、中、高剂量依次为33、150、267 mg/kg。给药途径：与临床用药途径一致，采用注射给药；给药次数和容积：一次性按体重计算给药量，小鼠给药体积为0.2 mL/(10 g)，大鼠给药体积为0.5 mL/(100 g)[11-12]。

1.4 对神经系统的影响

1.4.1 一般行为和自主活动 50只小鼠，适应性饲养3 d后，按体质量随机分为5组：空白组(与给药体积相同的生理盐水)，20 mg/kg戊巴比妥钠(阳性药物)组，蛴螬多糖低、中、高剂量组；每组10只。腹腔注射给药后，观察小鼠一般行为、姿势、步态、有无流涎、肌颤、眼球震颤和分泌物等变化。给药1 h后，将小鼠放入旷野箱，适应1 min后，计数10 min以内，小鼠在箱内活动的格数(小鼠四肢都进入同1格内才算走动了1格)。

1.4.2 机体协调运动实验 将一根光滑竖立的金属棒(直径为1.27 cm、长80 cm)，与地面垂直放置，并固定底部，保持直立。将小鼠放在金属棒的顶端上，让其自然向下爬行，筛选能够一步一步向下爬的小鼠50只，每组10只，雄雌各半，随机分为5组：空白组(与给药体积相同的生理盐水)，2.5 mg/kg盐酸氯丙嗪注射液(阳性药物)组，蛴螬多糖低、中、高剂量组；每组10只。腹腔注射给药1周后，30、60、120 min分别进行爬杆试验。观察小鼠协调运动能力，并进行评分。评分标准[13-14]：0分，一步一步向下爬；1分，向下滑行；2分，不能爬住棒；3分，翻正反射消失。

在大学阶段，新生最容易出现的问题就是目标迷失，随着生活环境和学习环境的改变，新生在适应新环境的过程中，在学习动力和学习目标方面会出现茫然的情况。在这种情况下，新生必须给自己寻找一个明确的人生目标，并为之制定合理的职业生涯发展规划。同时，可根据自身情况制定在校期间的一个短期目标。

1.4.3 小鼠镇静催眠实验[15-16]

1.4.3.1 入睡率 50只小鼠随机分为5组：空白组、10 mg/kg地西泮组(阳性药物，使用时用去离子水配制，灌胃给药)组、蛴螬多糖低、中、高剂量组，每组10只。各组给药1次，1 h后每组小鼠腹腔注射25 mg/kg(催眠阈下剂量)戊巴比妥钠。观察30 min，小鼠翻正反射消失达1 min以上者计为睡眠发生，计数各组睡眠发生的数目，计算入睡率，比较药物对阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的催眠作用[17]。

1.4.3.2 睡眠时间 50只小鼠随机分为5组：空白组、5.0 mg/kg地西泮组(阳性药物)，蛴螬多糖低、中、高剂量组。各组给药1 h后，小鼠腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠。观察和记录小鼠睡眠持续时间(翻正反射消失至恢复的时间)。

1.5 对心血管系统和呼吸系统的影响 将40只大鼠随机分成4组：空白组、蛴螬多糖低、中、高剂量组，每组10只，雄雌各半。大鼠仰卧位固定于鼠台上，BP-2010A型无创血压分析仪记录动物血压及心率，呼吸频率通过观察大鼠胸腹部的收缩和隆起情况测得。动物各记录指标稳定后开始实验，分别记录大鼠给药前、给药后1 h，2 h的血压、心率和呼吸的情况。

1.6 亚急性毒性试验评价及给药方法 将30只大鼠随机分成3组：设对照组和给药组，给药组按267 mg/kg、33 mg/kg分别腹腔注射给药，对照组以生理盐水腹腔注射，每组10只，雄雌各半。连续给药14 d，各组均自由饮水进食，末次给药1 h后，进行脏器系数测定、血常规检查、血液生化指标检查以及组织病理学检查。

1.6.1 血液细胞分析 连续给药14 d，末次给药1 h后，由腹主动脉取血，血液细胞分析仪测定血液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)数目、血红蛋白量和红细胞积压。

1.6.2 生化分析心脏、肝脏、肾脏重要指标 连续给药14 d，末次给药1 h后，由腹主动脉取血，3000 r/min离心15 min，取血清，生化分析仪测定AST、ALT、ALB、GLU、TG、TC、HDL-C、BUN和CRE等水平。

1.6.3 组织病理观察 连续给药14 d，末次给药1 h后麻醉处死大鼠，经解剖，分别取小鼠心、肝、肺、脾和肾，将各组织修剪固定，制作成石蜡切片，观察各组织病理学变化。简要的石蜡切片制作方法如下：4%甲醛组织固定、乙醇梯度脱水、浸蜡、包埋、切片、H.E.染色、二甲苯进行透明处理。

2 结果

2.1 对小鼠神经系统的影响

2.1.1 对自主活动和机体协调运动的影响 蛴螬多糖给药后，小鼠的一般行为和空白组无统计学差异(P>0.05)；给药后，在旷野箱内10 min内活动的格数空白组为(768.0±140.5)格；阳性药仅为(357.7±31.6)格，显著低于空白组(P<0.05)；蛴螬多糖低、中、高剂量组均与空白组无统计学差异(P>0.05)，见表1。此外，小鼠机体协调运动的爬杆试验发现，与对照组比较，蛴螬多糖给药后对小鼠机能协调功能无显著影响，而阳性对照氯丙嗪则影响显著，见表2。

表1 蛴螬多糖对小鼠自主活动的影响 (格，

注：与空白组比较，**P<0.01。

表2 给药后不同时间蛴螬多糖对小鼠爬杆评级的影响 (分,

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.1.2 对镇静催眠的影响 小鼠给药30 min后戊巴比妥钠阈下剂量睡眠发生的情况见表3。空白组无动物入睡，地西泮组入睡率为90%，蛴螬多糖各剂量组也无小鼠入睡。给药1 h后，各剂量组对戊巴比妥钠催眠剂量小鼠睡眠时间的影响见表4。地西泮组的睡眠持续时间为(340.5±70.1)min，明显高于空白组(111.0±29.7)min；蛴螬多糖低、中、高剂量组的睡眠持续时间分别为(145.7±52.8) min、(132.8±12.6 )min和(145.4±10.3 )min；中剂量和高剂量给药组与空白组睡眠持续时间有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

表3 蛴螬多糖对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量入睡率的影响

注：与空白组比较，**P<0.01。

2.2 对心血管系统的影响 采用小动物无创血压测定系统，虽然对照组收缩压指标有波动，但属大鼠正常波动范围内；各剂量蛴螬多糖组和对照组相比收缩压和舒张压均有明显升高作用(P<0.05)；蛴螬多糖对大鼠心率也有一定加快作用，但低、中剂量与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。见表5。

2.3 对呼吸系统的影响 3个剂量的蛴螬多糖对大鼠呼吸频率均无明显影响(P>0.05)。见表5。

2.4 亚急性毒性试验

2.4.1 一般症状 试验期间，给药组大鼠未观察到明显异常反应和中毒症状，行为活动、毛发、摄食、饮水、大小便均正常。给药组与对照组的体重差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

2.4.2 对小鼠脏器系数的影响 试验期间，给药组与对照组的心、肝、肾、脾、肺、胰腺脏器系数差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

组别潜伏期/s持续时间/min空白组85.5±26.2111.0±29.7地西泮组287.2±86.1∗∗340.5±70.1∗∗低剂量组130.2±71.5145.7±52.8中剂量组116.4±41.9132.8±12.6∗高剂量组114.4±17.6∗∗145.4±10.3∗∗

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别指标给药前给药后60min120min空白组收缩压/mmHg103.7±3.2 105.3±4.0 106.3±5.1 舒张压/mmHg89.7±3.884.0±11.483.7±2.3平均动脉压/mmHg94.3±3.591.3±9.0 91.3±3.1心率/t/min364.7±13.2366.0±7.0 376.0±10.5呼吸频率/t/min66.5±8.469.5±12.269.3±8.4

续表5

组别指标给药前给药后60min120min低剂量组收缩压/mmHg110.7±4.2 111.3±5.5 126.0±1.0∗∗舒张压/mmHg88.0±3.099.3±4.0 105.7±2.1∗∗平均动脉压/mmHg95.7±1.5103.3±4.2 112.7±2.1∗∗心率/t/min365.7±9.1 375.0±10.0378.0±6.6 呼吸频率/t/min 72.7±12.373.9±9.575.1±9.8中剂量组收缩压/mmHg 117.7±4.2∗∗ 127.7±2.3∗∗ 126.0±6.2∗舒张压/mmHg95.3±5.197.0±1.7 107.7±1.5∗∗平均动脉压/mmHg 102.7±2.5∗107.3±0.6∗ 114.0±2.6∗心率/t/min378.7±2.5 377.7±1.2∗381.0±4.4呼吸频率/t/min 76.3±12.578.0±11.7 78.8±11.4高剂量组收缩压/mmHg 124.0±6.2∗∗ 127.3±3.5∗∗ 127.7±7.5∗舒张压/mmHg98.7±5.7102.0±5.3 104.0±8.5∗平均动脉压/mmHg 107.3±5.5∗ 110.3±4.6∗ 113.3±8.6∗心率/t/min384.7±11.6 394.0±5.3∗∗ 393.0±1.0∗呼吸频率/t/min 69.0±10.8 69.4±12.2 70.4±13.9

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

指标对照组低剂量组高剂量组体重/g425.8±148.1427.7±57.0 385.8±108.3心脏指数(10×-3)3.12±0.283.13±0.463.06±0.24肝脏指数(10×-2)3.68±0.283.72±0.413.85±0.42脾脏指数(10×-3)2.32±0.522.31±0.322.43±0.20肺脏指数(10×-3)4.79±0.894.89±0.335.02±0.40肾脏指数(10×-3)3.97±0.393.94±0.233.96±0.36胰腺指数(10×-3)2.39±1.132.41±0.552.37±0.86

2.4.3 对血常规指标的影响 由血液生理指标可见，蛴螬多糖给药14 d，血液中红细胞数、血红蛋白含量、红细胞积压差异无统计学意义(P> 0.05)，高剂量蛴螬多糖组的白细胞数高于正常组(P<0.05)，血小板数量也增加明显(P>0.01)。见表7。

组别白细胞计数/×1012/L红细胞计数/×109/L血红蛋白/g/L红细胞积压/%血小板计数/×109/L对照组5.31±2.846.52±2.46109.7±30.737.32±14.01759.6±508.9低剂量组7.02±3.116.55±2.08113.2±31.236.14±10.59825.1±543.6高剂量组7.41±3.23∗6.72±1.44124.7±25.539.26±7.81 1050.5±398.1∗∗

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4.4 对血液生化指标的影响 蛴螬多糖给药14 d,对ALT、T-BIL、D-BIL、LDL-C、TBA、LDHi、LDH-L、CRE有一定的下调趋势，其中AST、TC显著低于空白组(P<0.05)，ALB、HDL-C极显著低于空白组(P<0.01)。蛴螬多糖组的GLU、ALP、UA和CK略高于正常组，但差异无统计学意义(P> 0.05)。见表8。

表8 蛴螬多糖对大鼠血清生化指标的影响 (n=3～9)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4.5 病理学观察结果 病理组织切片可以在细胞水平上反映毒物是否对器官造成了损伤。实验对心、肝、脾、肺、肾、胰腺、脑等器官制成的切片进行显微镜镜检(如图1)所示。结果表明对照组和蛴螬多糖实验组心肌细胞均无颗粒变性、脂肪变性等，细胞之间均未发现炎性细胞浸润，毛细血管均无内皮细胞胀、脱落等病理变化；对照组和蛴螬多糖实验组肝脏中肝小叶结构均完整清晰，肝小叶结构正常，无明显病理变化；对照组和蛴螬多糖实验组脾脏红髓白髓界限清晰，可以看出明显的生发中心；对照组和蛴螬多糖实验组肺泡结构完整无水肿等现象；对照组和蛴螬多糖实验组肾小球结构完整均一，均无肿大、出血现象；对照组和蛴螬多糖实验组的胰腺和脑也无明显病理变化。

图1 大鼠脏器组织病理切片(HE×200)

3 讨论

一般药理学研究也称为安全性药理学研究，主要观察受试物在治疗范围或治疗范围以上剂量时，潜在的不期望出现的对生理功能的不良影响，包括对中枢神经系统、呼吸系统、心血管系统等方面的影响，为新药用于临床提供安全性依据，是新药研究的重要内容[18-20]。

本实验严格参照中药一般药理学实验推荐方法[11-12]，评价对神经系统的影响时采用行为药理实验法类别下的镇静药物实验法和催眠药物实验法。镇静催眠药一般都能延长戊巴比妥钠的睡眠时间，本实验选用戊巴比妥钠和氯丙嗪作为阳性药物构建模型；使用BALB/c小鼠分别进行一般行为和自主活动机体协调运动实验、戊巴比妥钠阈下催眠剂量和睡眠剂量试验。实验所用BALB/c小鼠是国际近交系小鼠中常用品系，周晓冰等[21]也曾用BALB/c小鼠评价瑞格列汀对小鼠自主活动及协同睡眠的影响。评价对呼吸系统和心血管系统影响时选用常用的健康SD大鼠，采用直接测定指标的方法观察给药后不同时间大鼠呼吸频率、收缩压、舒张压、心率变化以评价蛴螬多糖对动物呼吸系统和心血管系统的影响。亚急毒实验主要观察动物在短期内是否出现毒性反应，为长期毒性试验和临床研究提供基础参考资料。目前常用健康SD大鼠，使用急性毒性给药方案，于给药后详细记录动物的饮食、饮水、死亡和尸体检验情况，并记录脏器与体重的变化，测定血液生化指标及病理检查。该法广泛用于毒理学评价，王振宇等[22]也曾用SD大鼠评价新型铂类化合物的肝毒性。

本研究统计分析组间比较采用单因素方差分析或t检验。t检验法又称t值法显著性检验，是最常用的处理定量资料的统计方法，该检验法在本研究中被用于两组均数的显著性检验；单因素方差分析适用于实验中只有一个因素改变的试验，本研究以蛴螬多糖给药剂量为单因素，采用单因素方差分析进行组间比较用于判断低、中、高不同给药剂量对实验指标的影响是否显著。

蛴螬多糖是将蛴螬经粉碎、碱水提取、醇液沉淀、双氧水脱色等一系列步骤分离纯化得到的，蛴螬多糖因具有抗肿瘤作用一直受到关注。归海霞等[23]发现蛴螬的活性成分多糖还具有降脂作用。但蛴螬多糖对心血管系统、呼吸系统、神经系统以及肝脏功能等方面的副作用尚未有报道，因此，本实验针对蛴螬多糖开展了一般药理学研究，为补充和完善其安全性实验数据奠定基础。本研究发现蛴螬多糖给药后，高、中、低3个剂量组对小鼠姿势、步态、肌颤、眼球震颤等一般行为无明显影响，不影响小鼠自主活动，与戊巴比妥钠阈下剂量无协同作用。蛴螬多糖3个剂量组经腹腔注射后可以升高大鼠血压和心率，但都属于血压和心率正常范围。

目前国内外还未见有关蛴螬多糖的毒理学研究报道。在课题组前期急性毒性实验中，无法测出蛴螬多糖半数致死量，改测腹腔注射最大耐受量为8 g/kg，表明该多糖毒副作用很小或无毒副作用。亚急性毒性试验中，与对照组相比，蛴螬多糖各剂量组对大鼠正常活动、体重、脏器系数影响的差异均无统计学意义，各主要脏器也无明显病理学改变；尽管对血常规、血液生化指标中的血小板数、AST、ALB、HDL-C、TC有一定影响，但仍在正常范围内，进一步说明蛴螬多糖安全范围大，具有较高的临床用药安全性。

综上所述，本研究初步证实蛴螬多糖在药效学有效剂量范围内有较高的安全性，并为开发蛴螬多糖相关新药提供了一般药理学数据。