基于形态学特征和psbA-trnH叶绿体编码基因序列明确五指山野生茶的分类地位

苏凡 杨小波 李东海

摘  要  海南的野生茶树在植物形态分类学上，在植物分类上一般都认为属于普洱茶（Camellia sinensis var. assamica），也有人认为是白毛茶（Camellia sinensis var. pubilimba）。五指山市以水满乡为代表，是海南野生茶分布的集中地区，为了进一步明确五指山市的野生茶分类地位，本研究通过在五指山市境内8个居群的野生茶植株的观察和测量。结果表明，五指山市野生茶树与茶（原变种）、普洱茶和白毛茶（茶的变种）等相比较，在形态方面，五指山市野生茶树更为接近普洱茶，但也有明显的区别，五指山市野生茶的叶子要比普洱茶、白毛茶的叶子大，侧脉稍多;从花形态分析，普洱茶的花瓣多为6～7枚，白毛茶为5～6枚，五指山市野生茶都是5枚。psbA-trnH叶绿体编码基因序列测序结果进一步表明，8个居群的五指山市的野茶30个样品为独立的一组，与普洱茶、白毛茶并列。我们认为五指山市野生茶也可确定为茶（原变种）的另一个变种，因此，命名为海南五指山水满茶（Camellia sinensis （Linnaeus） Kuntze var. shuiman F.Su and X.B.Yang），简称水满茶。

关键词  形态特征;分子鉴定;psbA-trnH;野生茶;水满茶;五指山

中图分类号  S571.1      文献标识码  A

Abstract  The wild tea in Hainan Island was regarded Camellia sinensis var. assamica （CSA） or C. sinensis var. pubilimba （CSB）. The concentrated distribution area of the tea is Shuimanxiang， Wuzhishan. In order to further clarify the classification status of the tea， the wild tea plants of eight communities were studied. The morphological characteristics of the tea were closer to CSA than CSB. But there were also obvious differences， since the leaves of the tea was larger than that of CSA and CSB， the side veins of the tea was slightly more than that of CSA and CSB， and the petals of the tea， CSB and CSA was 5， 5-6 and 6-7， correspondingly. The sequence of the psbA-trnH chloroplast coding gene showed that the 30 samples of the eight communities of the tea was an independent group， which is parallel to CSA and CSB. So， the wild tea could also be identified as another variety of C. sinensis. It was named as Camellia sinensis （Linnaeus） Kuntze var. shuiman F. Su and X. B. Yang， short for Shuiman Tea.

Keywords  morphological characteristics; molecular identification; psbA-trnH; wild tea; Shuiman tea; Wuzhishan

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.016

在我國关于茶组植物的分类一直都存在争议，张宏达[1]在1981年将茶组植物分为17种3变种，1984年订正后为37个种3个变种[2]，又在1998年修订为4个变种[3];闵天禄[4]1992年在张氏系统基础上将茶组植物进行归并，将茶组植物分为12种6变种;陈亮等[5]2000年全面考察了茶树种质资源的分子生物学系统， 提出将茶组植物分成5种3变种，将茶组植物分为大厂茶Camellia tachangensis F. S. Zhang、厚轴茶C. crassicolumna Chang、大理茶C. taliensis（W. W. Smith）Melchior、秃房茶C. gymnogyna Chang和茶C. sinensis （L.） O. Kuntze等5个种， 在茶下分茶C. sinensis var. sinensis、普洱茶C. sinensis var. assamica （Masters）Kitamura、白毛茶C. sinensis var. pubilimba Chang等1个原变种，2个变种。海南分布的野生茶有两个变种，一个为普洱茶变种，俗称‘海南大叶茶，在五指山市称‘水满茶[5-7]，另一个为白毛茶[5]。经过全面调查，发现海南的野生茶在海南分布较广泛，但最集中的分布区为五指山市及其与琼中县的交接区域，以水满、畅好、冲山和南圣等乡镇一些山坡上[8]。目前在海南仅在五指山市形成野生茶栽培与制茶产业，为了明确分布在五指山市境内的野生茶的分类地位，有必要结合形态特征和DNA条形码技术对该地区的野生茶进行鉴定与分类。

DNA条形码（DNA barcoding）技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术[9]。生命条形码联盟（CBOL）结合以往研究所提供数据的分析结果，建议将叶绿体基因rbcL、matK、psbA-trnH和核基因ITS作为陆地植物通用的DNA条形码[10-11]。除了以上这4种DNA条形码序列，trnL、rpoC1、rpoB、ndhJ等DNA片段也常作为植物的DNA条形码序列[12]。

DNA条形码技术已经开始应用于茶属植物种资资源、亲缘关系方面[13-14]。杨俊波等[15]通过线粒体matR基因序列去分析研究了山茶科的分类学范围和系统演化关系，结果表明山茶亚科和厚皮香亚科不构成姐妹群关系;范文等[16]应用DNA序列分子标记对香港红山茶（Camellia hongkongensis）个体内多态性研究并对物种进行分子鉴定，确定采集样本是香港红山茶;Shih等[17]在2017年利用核糖体内转录间隔区序列对台湾茶叶和进口茶叶的品种鉴定，为台湾茶叶品种的鉴定分类提供了分子证据。因此，本文在详细比较分析五指山市的野生茶与茶（原变种）、普洱茶、白毛茶的形态特征基础上，选取五指山市畅好什冲岭、南圣毛祥1、南圣毛祥2、番赛村、毛道新泰南岭、水满、水满东松岭、仕阶8个野生茶树居群，每个居群采10份样品，共80份样品，利用叶绿体基因rbcL、matK、psbA-trnH和核基因ITS对五指山市野生茶树进行PCR扩增后直接测序，将所测的序列在NCBI上进行BLAST找到普洱茶和白毛茶序列并进行对比，明确五指山市野生茶的分类地位。

1  材料与方法

1.1  材料

五指山野生茶开花季节主要为11月至次年2月[18]，本研究选取野外观察和测量的时间是2016年10月—2017年8月。通过对基本覆盖五指山市区野生茶分布区的8个野生茶居群（表1，图1）的野生茶植株的形态综合特征进行测量，每个种群观察的植株为10株，采摘相对标准的成熟叶片，测量叶数量为30片，对野生茶的叶、花、果实进行测量并记录，采样10份（表1）。茶（原变种）、普洱茶和白毛茶的形态特征来自《中国植物志》 [3， 19]。

1.2  方法

1.2.1  试验设计  在上述的每个野生茶树分布点处，随机选择10株野生茶树个体植株进行采样，采样时应该避免采种株间的亲缘关系较近，每株之间相距10 m;采集当年生的新鲜幼嫩叶片作为提取基因组DNA的材料，每份样品采集1份DNA材料，DNA材料应采集3～5 g叶片;8个群落样方，共80份样品。将新鲜的植物DNA材料置于柔软且透气性较好的纸袋中进行干燥并带回实验室，装在预先准备放有硅胶的信封中，再用封口袋密封，带回实验室放在20 ℃冰箱中保存。

1.2.2  总DNA的提取  选择4个通用引物片段，其中叶绿体基因有3个分别为rbcL、matK、psbA-trnH，核基因有1个为ITS，与野茶样品反应。PCR扩增反应总体积为25 μL，反应液包含：上下游引物各1 μL，无菌水9.5 μL，mix12.5 μL，DNA样品1 μL。扩增程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循环;最后72 ℃延伸10 min，rbcL、psbA-trnH、matK和ITS序列的退火温度分别为54、55、51、50 ℃，退火1 min。PCR反应在analytik jena梯度PCR仪上进行。最后把提取出的符合下一步PCR扩增的DNA样品储存于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3  测序与序列分析  PCR扩增的DNA样品经过测序所获得的序列采用BioEditver 7.0.9.1软件[20]编辑并进行人工校对。利用MEGA ver 6.0软件做NJ进化树[21]。

2  结果与分析

2.1  五指山市野生茶树与普洱茶、白毛茶形态特征比较

五指山市野生茶树的8个居群植株的形态特征，总体可描述为：高大乔木，小枝幼时有柔毛;叶卵状椭圆形、长圆状披针形，倒卵状椭圆形、倒披针状椭圆形，叶子常为长13～19 cm、宽5～8 cm，幼叶有不显著齿或波状齿，老叶锯齿深明，常大小相间;侧脉11～13对，叶柄5～7 mm，被柔毛。花腋生，白色，花柄长5～7 mm，被柔毛; 苞片2，早落;萼片5，近圆形，长3～5 mm，无毛;花瓣5片，倒卵形，有时为披尖形，长1～2 cm;雄蕊长8～10 mm，离生;子房被茸毛，花柱长7 mm， 先端3裂。蒴果扁三角球形或1个圆球形，直径约1.5～2 cm，3爿裂开。种子每室1个。总体上，五指山野生茶从形态特征上看，与茶（原变种）和白毛茶差异稍大一些，与普洱茶较为接近，但也有一定的区别：五指山野生茶的叶子要比普洱茶的要大一些，普洱茶的叶子长8～14 cm，宽3.5～7.5 cm，且五指山野生茶的叶子长13～19 cm，宽5～8 cm;五指山野生茶的侧脉也比普洱茶多一些，普洱茶的侧脉8～9对，而五指山野生茶的侧脉11～13对;在花的形态方面，五指山野生茶的花瓣5片，普洱茶的花瓣6～7片，两者均为蒴果，种子每室1个，但五指山野生茶的蒴果有扁三角球形和圆球形，果爿厚1.5～1.7 mm，普洱茶的蒴果仅描述为扁三角球形，果爿厚1～1.5 mm（表2）。

五指山市8个居群的野生茶树在形态特征上也有一些差异，主要可分为低海拔组和中高海拔组2组，如图2A、图2C、图2D、图2F拍摄于畅好什冲岭海拔（735 m），为低海拔组;图2B、图2E、图2G拍摄于水满东松岭海拔（1031 m），为中高海拔组。畅好什冲岭低海拔组的野生茶叶长圆形或椭圆形，先端钝或尖锐，锯齿深明，叶面平，革质化相对明显;东松岭高海拔组的野生茶树叶子偏大长，东松岭的野茶叶子卵圆形，叶脉突兀，嫩叶先端渐尖。从叶形上看，低海拔组的叶子似乎像茶（原变种）（表2），可能低海拔组的野生茶被栽培茶（原变种）“基因污染”。这有待于进一步研究。

2.2  五指山市野生茶树鉴定与分类分析

2.2.1  扩增引物的筛选  用4对通用引物进行PCR扩增后，再将扩增产物进行测序，发现只有psbA-trnH引物扩增的产物测序成功，其他3对引物的测序结果不理想，不可用作五指山野生茶种质资源鉴定与分类（表3）。核基因ITS序列在山茶属中直接测序较为困难，这可能与该属ITS区序列GC含量较高，种类的杂交和多倍化现象，以及ITS一致性进化是否完全等因素有关，这些因素在一定程度上限制了核基因ITS在山茶属中的应用[13]。而在叶绿体基因组中，其DNA片段容易扩增和测序，但叶绿体基因组序列相对保守，进化速率较慢，经过筛选，只有psbA-trnH引物叶 叶片下面无毛或初时有柔毛;边缘有锯齿。 嫩枝及叶片下面均被有密柔毛;叶边缘锯齿不明显;叶柄无毛。 嫩枝有微毛，顶芽有白柔毛;侧脉8～9对，叶边缘有细锯齿;叶柄被柔毛。 侧脉11～13对，有不显著齿或波状齿，老叶锯齿深明，常大小相间;叶柄被柔毛。

花 花腋生，白色;萼片无毛。 花腋生，白色，花特别小，萼片被灰白色 花腋生，白色，花柄被柔毛;萼片无毛;花瓣6～7片，背面无毛。 花腋生，白色，花柄被柔毛;萼片无毛;花瓣5片，倒卵形，有时为披尖形。

果实 蒴果3球形或1～2球形，每球有种子1～2粒。花期10月至翌年2月。 蒴果3球形或1～2球形，每室有种子1～2粒。 蒴果扁三角球形，3爿裂开，种子每室1个。 蒴果扁三角球形或1个圆球形，3爿裂开，种子每室1个。

2.2.2  系统树的构建和分析  80份五指山野生茶材料的PCR成功率为100%;测序所得80份野茶psbA-trnH叶绿体编码基因序列共30条，成功概率为37.5%;测定的五指山野生茶的psbA-trnH区序列长度为658～687 bp。将所测的的序列在NCBI上进行BLAST找到普洱茶和白毛茶序列并进行对比（图3）。结果表明，在NJ（neighbor joining）系统发育树上聚集发现KJ806281（普洱茶）并不是五指山野生茶亲缘关系最靠近，却与KJ806280（白毛茶）亲缘关系靠近，所有五指山野生茶的样品聚集在一起，与白毛茶、普洱茶有一定的分离。此结果表明五指山野生茶与白毛茶和普洱茶都有一定的分离。

3  讨论

五指山市为海南野生茶树的主要分布区[8]，且相对集中分布在该市的东南区域，尽管有报道称海南有白毛茶的分布[5]，但经过详细的形态特征比较分析和我们的研究结果认为分布在海南五指山市的8个居群的野生茶树在形态上与白毛茶相差较远，与普洱茶相似，但也有差别（表2）。结合形态特征与分子技术来明确某一植物居群的分类地位从已经越来越普遍。例如，Liu等[22]2018年通过形态学观察和测定叶绿体基因的matK、rbcL和trnL-F等3个基因片段并构建系统关系树，发现了蕨类新物种——印禅双盖蕨;陆丽华等[23]结合形态学和分子标记法去鉴定几种危害严重的苋属入侵植物;Jie等[24]在2018年通过形态学和分子标记法鉴定中国的黄精属植物，进一步验证了分子标记结果的准确性和可靠性;温贝貝[25]运用DNA条形码检测技术，选取叶绿体基因组中的序列rbcL、matK、psbA-trnH序列与核基因组中的ITS，ITS2序列作为DNA条形码候选片段，验证其对山茶属植物的应用效力，以期在不受同属植物外部形态特征相似的情况下对山茶属植物进行鉴定，分析其亲缘关系及物种演化进程。本研究以psbA-trnH基因区间条形码也成功鉴定五指山野生茶和普洱茶、白毛茶之间的亲缘关系，且聚类的结果是，普洱茶与白毛茶较接近，为一组（图3），所有8个居群的五指山野生茶为另一组。普洱茶和白毛茶均为茶原变种的变种[3]，我们认为五指山野生茶应是茶原变种的另一个变种。在五指山市野生茶这一组中，可细分两亚组，第一亚组为南圣毛祥2-12与番赛-25这两份样品，在进化树图上，他们亲缘关系更为靠近;其他26份样品归为第二亚组。这一结果可为五指山市野生茶树新分类群的建立提供了分子水平的证据。

4  结论

通过植物形态特征和DNA序列鉴定技术相互结合起来对五指山野生茶进行鉴定与分类，为五指山野生茶新分类群的建立提供了分子水平的证据。总体上看，五指山野生茶在形态特征上更接近普洱茶。以psbA-trnH叶绿体编码序列鉴定结果表明，3种茶应是并列的，或者说，普洱茶和白毛茶还更接近一些，所有8个居群的五指山野生茶样品都较接近，独立于普洱茶和白毛茶。因此，我们认为五指山野生茶是茶（原变种）的另一个变种，命名为海南五指山水满茶（Camellia sinensis var. shuiman F. Su and X. B. Yang），简称水满茶。

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