QuEChERS－液相色谱/高分辨质谱技术分析茶叶中农药残留

卢巧梅

(福州大学测试中心，福州大学食品安全与生物分析教育部重点实验室，福建福州 350108)

0 引言

茶叶中的农药等药物残留直接影响茶叶品质和公众身心健康.日本、美国等国家对茶叶中农药残留制定了严格的限量标准，我国也规定茶叶中不同种类的农药最大残留量介于0.01～20 mg·mL－1［1］.因此，亟需一种高通量、高灵敏的农残检测技术.快速样品前处理技术(QuEChERS)［2］利用吸附剂与基质中杂质相互作用实现除杂净化目的.该方法操作简单、回收率高，已被广泛应用于不同农产品中药物残留的快速分析.液相色谱－串联质谱(HPLC－MS/MS)以选择性强、灵敏度高的特点，在多农残检测中应用广泛［3－6］.四级杆飞行时间质谱分辨率高、特异性强［7－8］，并能获取目标物一级和二级质谱的精确质量数，结合色谱保留时间信息，能更高效地筛查和确证复杂样品中痕量组分.实验基于简便、快速的QuEChERS前处理，结合串联质谱定性准确和定量灵敏度高的特点，建立检测久效磷等18种农药残留的方法体系，高效分析茶叶样品中的痕量农药残留，为茶叶的检测技术和质量安全监控提供方法支持.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

1260系列液相色谱和G6520型四级杆－飞行时间质谱仪(美国Agilent公司);QuEChERS试剂盒(美国Agilent公司).

农药标准品由福建省产品质量检验研究院提供.乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵为色谱纯(美国Sigmaaldrich公司)，实验用水为超纯水(Milli－Q型超纯水系统，美国Millipore公司).所有试剂使用前经过0.22 μm滤膜(上海新亚净化器件厂)过滤.

不同批次的红茶(F0116、W4398、W4417)和绿茶(F0036、F0140、F0118)产自福建省安溪县，由国家茶叶质量监督检验中心提供.

1.2 溶液制备和工作曲线绘制

混合标准溶液的制备:用甲醇溶液分别将18种农药(久效磷、敌百虫、磷胺、对氧磷、杀扑磷、嘧菌酯、腈菌唑、三唑磷、丙线磷、苯线磷、杀虫畏、稻丰散、毒虫畏、丙环唑、异丙胺磷、吡唑硫磷、伏杀磷、丙烯菊酯)标准溶液稀释成25 mg·mL－1的单标储备液，再用甲醇配制成质量浓度为1 μg·mL－1的混合标准溶液，4℃避光保存.

工作曲线绘制:将1 μg·mL－1混标溶液用甲醇准确稀释成一系列质量浓度.在最优条件下测定，根据峰面积与相应质量浓度的关系绘制工作曲线.

1.3 色谱－质谱条件

Hypersil GOLD aQ C18 色谱柱(250 mm×3 mm，i.d.，5 μm; 美国 Thermo Scientific公司); 柱温 25℃;进样体积10 μL;流动相A为二次水，流动相B为甲醇;流速:0.5 mL·min－1.梯度洗脱程序:0～3 min，60%B;3～8 min，60%～70%B;8～16 min，70%～65%B;16～20 min，65%～70%B;20～21 min，70%B;21～23 min，70%～80%B;23.01 min，60%B，保持7 min.正离子扫描(ESI+);多反应监测(MRM);干燥气温度325℃;干燥气流量8 L·min－1;雾化气压力241.325 kPa;碎裂电压135 V.18种农药的质谱采集参数见表1.

表1 18种农药的质谱采集参数Tab.1 MS acquisition parameters of 18 pesticides

1.4 样品处理

称取5.00 g茶粉样品于50 mL塑料离心管中，分别加入10 mL二次水和10 mL乙腈(含0.1%乙酸(体积分数，下同))，混合均匀，加入Agilent Bond Elut提取试剂盒，快速振荡2 min，8 000 r·min－1离心3 min.取上清液2 mL，加入Agilent Bond Elut净化试剂盒，8 000 r·min－1离心3 min，取上清液1 mL，过滤，待测.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

为保证18种物质能达到较好的分离效果，采用单因素实验法，分别考察流动相组成、流速、柱温和梯度洗脱程序等因素对色谱分离的影响.重点对流动相方案进行优化.试验了甲醇－水、乙腈－水作为流动相对目标物分离效果的影响.结果表明，当有机相为甲醇时，大部分组分的峰形更为尖锐对称.进一步考察水相添加剂(甲酸或甲酸铵)对分离效果

的影响，如图1所示，水相中加入甲酸或甲酸铵，腈菌唑和三唑磷(8号和9号峰)分离度较差.因此，确定甲醇－水溶液作为流动相，并采用梯度洗脱程序以获得更好的分离效率.

增大流速能有效提高分离效率，但过高的流速会导致质谱离子化效果变差.实验固定其他条件不变，考察流速 0.3～0.6 mL·min－1对物质分离效果的影响.综合考虑色谱分离度和质谱响应，最终确定0.5 mL·min－1为最佳流速.考察 25～40 ℃范围内柱温对分离效果的影响.实验发现，柱温对上述物质的总体分离效果影响很弱，故选择25℃作为分离体系的柱温.

2.2 质谱响应情况

图1 不同流动相对18种农残分离的影响Fig.1 Effects of different mobile phases on separation of 18 pesticide residues

实验对比了目标物在ESI正负检测模式下的响应情况.鉴于18种农药结构中大多含有N、P等杂原子，易形成［M+H］+、［M+Na］+等加合离子，适合用ESI(+)检测.其中，嘧菌酯、腈菌唑、三唑磷、丙环唑等4种物质选择［M+H］+形式定性定量，其他14种物质选择响应更强的［M+Na］+形式.丙环唑可能存在同分异构体，在19.56、20.47 min都有较强信号.继续考察影响离子化的参数，最终确定干燥气温度325℃;干燥气流量8 L·min－1;雾化气压力241.325 kPa.在上述条件下，18种组分的选择离子流(EIC)信号见图2.

2.3 方法验证

配制一系列质量浓度的农药混合溶液，以质量浓度为横坐标，以各物质的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.检测限以3倍信噪比计算，各物质的定量分析参数如表2所示.结果表明，方法线性关系良好(R≥0.997 1)，检测限介于0.50～8.00 ng·mL－1之间.选取10 ng·mL－1进行精密度实验，日内和日间的RSDs均小于8.06%(n=5)，表明方法具有良好的稳定性和重现性.

图2 18种农残的最优EIC谱图(出峰序号同图1)Fig.2 Optimal EIC spectra of 18 pesticide residues(the peak identification were the same as those in Fig.1)

表2 线性回归方程及相关系数Tab.2 Equation of linear regression and correlation coefficient

2.4 实际样品分析

QuEChERS前处理方法基于文献［9］并加以改进.考察乙腈、丙酮、乙酸乙酯作为提取剂时目标物的回收率.结果表明，乙腈提取茶叶样品时，色谱图杂峰相对较少.继续往乙腈中加入0.1%乙酸，样品的回收率略微提高，故最终选择乙腈(含0.1%乙酸)作为样品提取溶剂.茶叶样品经提取净化后，仍存在一定基质干扰，基质与1号峰久效磷、18号峰丙烯菊酯的保留时间相当接近(见图3)，但提取精确质量显示，实际样品均未测得18种化合物.

选择固定批次的红茶(W4398)和绿茶(F0036)两份样品，分别加入低、中、高(10、80、800 ng·mL－1)3种质量浓度的混标样品，计算加标样品的回收率和RSDs值.结果表明，W4398样品的加标回收率在84.2%～122.3%之间，RSDs值为 0.3%～6.2%;F0036 样品的加标回收率在 95.1%～121.0%之间，RSDs值为 0.6% ～6.1%.

图3 不同茶叶样品空白和加标的总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of blank and spiked tea samples

3 结语

采用QuEChERS方法结合高效液相色谱－串联质谱技术，建立了不同批次茶叶中多种农药残留的分析体系.方法定性能力强、准确度高，能够满足农产品中农药残留的快检要求.