高温胁迫对德尔卑沙门氏菌抗逆性的影响

翟立公 杜传来 杨 晴 陈 晨 王俊颖

(安徽科技学院，安徽 滁州 233100)

在世界范围内，每年由沙门氏菌引起的食物中毒事件达到8 030万件，造成15.5万人死亡[1]；在中国，细菌性食物中毒事件中，70%～80%是由沙门氏菌引起的[1-3]。沙门氏菌感染人体后潜伏期短，发病突然，能引起感染者的腹泻、发热等症状，严重者会引起菌血症[4]。沙门氏菌致病主要是通过食源性感染引起的，全球沙门氏菌病病例中有85.6%是食源性感染[5]。沙门氏菌包括2 600多个血清型，但污染食品的血清型主要集中在肠炎沙门氏菌亚种中的部分血清型[6]。德尔卑沙门氏菌(SalmonellaDerby)在中国的猪肉、鸡肉类食品中检出率较高[7-8]。食品在加工过程中，不同胁迫条件的复合作用，有助于提高食源性致病菌的抵抗能力，降低杀菌效果，将引起重要的食品安全问题[9]。Fong等[10]发现，当沙门氏菌经过亚致死(45 ℃、3 min)处理后，其耐热性明显提高。有研究[10-12]表明，热适应性沙门氏菌对UV辐射的抗性增加；当沙门氏菌处于干燥环境下，其高温的耐受性也会相应增强。经过亚致死高温胁迫能改变沙门氏菌毒性基因的表达，提高宿主细胞的被感染率[13]。

在食品加工及贮藏过程中，沙门氏菌会受到多种胁迫因子的交叉协同作用，造成其对环境耐受性的改变。研究[14]发现，酸适应性沙门氏菌当遇到低温、高温、高渗等环境下，其存活率显著高于非适应性菌，但对NaClO等消毒剂却更为敏感。在食品加工过程中，加热处理是最常用的一种灭菌手段，可有效消除食品及加工器具上的食源性致病菌，防止致病菌的传播。当加工过程中加热温度及时间未达到灭菌要求时，会造成污染的沙门氏菌处于亚致死状态，促使其开启热胁迫应答机制维持其正常的生命活动，从而提高其对高温胁迫的耐受性[15]。然而，在食品加工过程中沙门氏菌常处于多种胁迫因子的共同作用。因此，针对高温耐受沙门氏菌对其他胁迫因子交叉抗性的研究将变得非常重要。本试验拟以德尔卑沙门氏菌(SD)为对象，主要研究沙门氏菌经高温胁迫后，对其他环境胁迫因子的耐受性影响，为食品加工业针对高温耐受沙门氏菌选择合适灭菌、保藏技术提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

德尔卑沙门氏菌(S. Derby)：中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC50719)。

柠檬酸、NaClO：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

乙酸、NaCl、30%过氧化氢、乙醇(95%)：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

LB培养基：青岛海博生物技术有限公司；

胰蛋白酶大豆蛋白胨培养基(TSB)：青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

二级生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X型，济南鑫贝西生物技术有限公司；

台式恒温培养箱：THZ-92A型，上海跃进医疗器械有限公司；

智能恒温恒湿培养箱：LHP-160型，上海三发科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 德尔卑沙门氏菌高温耐受株驯化 德尔卑沙门氏菌(CMCC50719)经LB液体培养基活化后，划线培养，挑取单菌落，转接到LB液体培养基，43 ℃、180 r/min培养36 h，再接到LB固体培养基，43 ℃培养，如此反复进行多轮驯化。将驯化获得的高温耐受菌株和对照菌株分别接入LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养10 h，平板菌落计数法获得以上菌株的初始浓度。同时，各取1 mL培养液，10 000 r/min离心1 min，弃上清，分别加入1 mL无菌生理盐水，重悬。将两管菌液置于55 ℃，处理20，25，30 min，用无菌生理盐水10倍梯度稀释，取适宜稀释度平板菌落计数。按式(1)计算存活率，评价德尔卑沙门氏菌高温耐受株的耐受性[14]。

存活率=(处理后菌落数对数值/处理前菌落数对数值)×100%。

(1)

1.3.2 高温耐受稳定性分析 将德尔卑沙门氏菌高温耐受菌株连续培养10代，经55 ℃水浴，处理30 min，测定高温耐受菌株和对照菌株的存活率。

1.3.3 高温耐受SD菌株环境胁迫抗性分析 高温耐受菌株和对照菌株，分别经LB液体培养基，过夜培养，取1 mL 菌液离心，弃上清，根据以下方法处理，测定高温耐受SD的环境胁迫性分析。酸胁迫：用柠檬酸或乙酸分别将生理盐水的pH调整到2.4，3.0，各取1 mL加入，重悬菌体(处理30 min)；碱胁迫：用NaOH将生理盐水的pH调整至10，11，12，各取1 mL加入，重悬菌体(处理30 min)；乙醇胁迫：配置60%，65%，70%的乙醇溶液，各取1 mL加入，重悬菌体(处理3 min)；过氧化氢胁迫：将30% H2O2与无菌水配置成25，75，125 mmol/L的溶液，各取1 mL，重悬菌体(处理30 min)；次氯酸胁迫：用无菌水分别配置0.1%，0.5%，1.0%NaClO溶液，各取1 mL，重悬菌体(处理15 min)；低温胁迫：用1 mL生理盐水重悬菌体后，置于-20 ℃冰箱冷冻处理22 d。以上菌体经过环境胁迫处理后，10 000 r/min离心1 min，弃上清液，加入1 mL生理盐水重悬，利用平板菌落计算法对胁迫前后菌落计数，计算胁迫后菌体存活率。

1.3.4 数据统计分析 每组试验设3次重复，利用SPSS 19.0和Origin 7.0软件对数据进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 高温耐受SD菌株驯化及高温耐受稳定性

SD经长时间43 ℃驯化培养，获得的菌株，在55 ℃胁迫条件下的存活率如图1所示。当胁迫时间仅为20 min 时，高温耐受菌株的存活率达到61.9%，而对照菌株的存活率仅达到41.19%，差异显著；当胁迫时间增加到25 min后，高温耐受菌株的存活率也显著高于对照菌株；但随着胁迫时间的延长，驯化菌株的存活率略高于对照菌株。表明经高温驯化后，对高温胁迫的耐受性具有胁迫时间的相关性，随着胁迫时间延长，耐受性降低。

*表示差异显著(P<0.05)

Figure 1 Survival rate of high temperature SD resistant strain and control strain at 55 ℃ for different treatment time

高温耐受菌株和对照菌株分别经10次传代后，在55 ℃ 胁迫条件下，高温耐受菌株的存活率为47.3%仍高于非耐受菌株的38.73%，该结果表明，驯化后的菌株仍保持较好的高温耐受性。

2.2 高温耐受SD菌株酸胁迫抗性

利用柠檬酸或乙酸配置pH 3.0，2.4的无菌生理盐水溶液，重悬高温耐受菌株和非高温耐受菌株，室温放置30 min，存活率结果见图2。当菌体处于柠檬酸配置的pH 3.0胁迫条件下，高温耐受菌株和非高温耐受菌株的存活率均最高，但驯化后菌株的存活率(97.79%)仍高于未被驯化的菌株(85.91%)。当处于pH 3.0环境下，柠檬酸处理后的高温耐受菌株和对照菌株的存活率要高于乙酸处理后的高温耐受菌株和对照菌株，表明在此条件下乙酸对SD的杀菌效果更好。当菌株处于pH 2.4胁迫条件下，柠檬酸处理的高温耐受菌株的存活率略高于非高温耐受菌株的存活率；乙酸处理后，非高温耐受菌株完全灭活，高温耐受菌株的存活率达到46.7%，具有显著性。以上结果表明，SD的高温耐受性增强，同时也提高了对酸环境胁迫的抗性。但有研究[16]结果显示，当沙门氏菌长期处于低酸环境，反而降低沙门氏菌对高温的耐受性。

2.3 高温耐受SD菌株碱胁迫抗性

如图3所示，当沙门氏菌处于低碱环境下，高温耐受菌株和对照菌株的存活率均较高；在pH 10胁迫条件下，对照菌株(91.02%)的存活率仅高于高温耐受菌株(86.21%)存活率4.81%，差异不显著；在pH 11胁迫条件下，高温耐受菌株和对照菌株存活率相差7.16%，与pH 10 胁迫条件的结果相似。当SD处于pH 12时，对照菌株的存活率下降明显达到33.83%，而高温耐受菌株甚至全部死亡。该结果表明，高温耐受SD对碱环境较为敏感，其抗性较差，可以采取碱处理方式提高对高温耐受SD的灭菌效果。

*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著

Figure 2 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at acid stress

图3 高温耐受SD菌株和非高温耐受菌株在碱胁迫的存活率

Figure 3 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at alkaline stress

2.4 高温耐受SD菌株乙醇胁迫抗性

在相同胁迫时间下，乙醇浓度从60%增加到65%时，对照菌株和高温耐受菌株的存活率均大幅下降，对照菌株和高温耐受菌株的存活率分别下降了47.03%，39.66%。当60%乙醇胁迫时，对照菌株的存活率(82.93%)是高温菌株存活率(66.04%)的1.26倍，差异显著；当65%的乙醇溶液短时处理后，对照菌株的存活率(35.90%)是高温耐受菌株存活率(26.38%)的1.36倍，差异显著。但当处于65%，70%乙醇浓度时，高温耐受菌株存活率变化较小。本研究发现，高温耐受SD对乙醇的敏感度更大，且随着乙醇浓度的升高，其消毒效果也更加明显。但有研究[17]表明，沙门氏菌经低浓度的酒精(5%)胁迫，有助于提高肠炎沙门氏菌的酒精耐受性，但对55 ℃高温胁迫影响较小。当微生物的胁迫顺序发生改变，将直接影响沙门氏菌的耐受性。

*表示差异显著(P<0.05)

Figure 4 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at ethanol stress

2.5 高温耐受SD菌株过氧化氢胁迫抗性

过氧化氢利用活性氧的氧化能力，破坏原生质体，实现对微生物消毒灭菌的目的，多用作食品及加工器械的消毒剂[18]。如图5所示，随着环境中H2O2浓度的提高，高温耐受菌株的存活率影响不大，基本稳定在90%左右；但对对照菌株的存活率影响较大，当H2O2浓度从75 mmol/L 提升到125 mmol/L时，对照菌株的存活率下降了27.76%。以上结果表明，高温胁迫有助于提高SD对H2O2氧化胁迫的耐受性，降低H2O2对SD的消毒灭菌效果。刘佳玫等[14]发现酸适应性海德尔堡沙门氏菌对H2O2的耐受性增强。

**表示差异极显著(P<0.01)

Figure 5 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at H2O2stress

2.6 高温耐受SD菌株次氯酸钠胁迫抗性

选用0.1%，0.5%，1.0%的次氯酸钠溶液对高温耐受菌株胁迫处理，结果见图6。在不同浓度NaClO溶液处理30 min，高温耐受菌株的存活率低于对照菌株。该结果表明，经高温耐受性处理后SD对NaClO的敏感性增加，增加了高温耐受菌株的死亡速率。有研究[19]发现，酸适应性鼠伤寒沙门氏对NaClO胁迫条件的敏感性也有显著提高。通过高温和酸处理，有助于提高NaClO对SD的灭菌效果。

2.7 高温耐受SD菌株冷冻胁迫抗性

-20 ℃冷冻保藏是食品冷藏，延长货架期常用的一种食品保藏手段。将SD高温耐受菌株和对照菌株放置-20 ℃冰箱冷冻保藏2～22 d，测定两种菌株的存活率，结果见图7。当冷冻2 d时，对照菌株存活率(65.86%)下降明显，相比于高温耐受菌株的存活率(89.7%)下降了23.83%，差异极显著；随着冷冻时间延长到13 d，对照菌株存活率基本保持稳定，但延长到22 d时，对照菌株的存活率下降到46.22%。在相同时间的冷冻胁迫下，高温耐受菌株的存活率均高于对照菌株的存活率。该结果表明，未经过高温处理的SD对冷冻胁迫较为敏感，高温胁迫能够增加SD对低温冷冻环境的抗性。

图6 高温耐受SD菌株和非高温耐受菌株在NaClO胁迫的存活率

Figure 6 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at NaClO stress

*表示差异显著(P<0.05)

Figure 7 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at low temperature stress

3 结论

沙门氏菌的最适生长温度在37 ℃，本研究在43 ℃条件下进行传代培养，经过多轮驯化后发现该菌株在55 ℃ 处理下的存活率明显高于对照菌株。因此，在实际生产过程中，为达到消毒灭菌的效果，应采取足够的温度和时间进行处理。

当沙门氏菌暴露在压力环境下能产生对其他胁迫条件的联合耐受性[20-21]。本试验揭示了高温耐受菌株对其他食品加工、贮藏等胁迫环境下的存活状态，当沙门氏菌经过高温驯化后，对低酸、低温和H2O2等胁迫条件具有较好的耐受性，但对乙醇、碱和NaClO等环境的耐受性降低。沙门氏菌经高温胁迫后，启动自身的热胁迫抗性调节网络，能够维持细胞正常的生命活动，但对其他环境胁迫的耐受性表现存在较大差异。因此，对热抗性的调控机制仍有待进一步的深入研究。