下调NDRG4表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

刘巍，贾朝阳，潘文婧，白晓絮，冯书君，谭文华

(哈尔滨医科大学第二附属医院，哈尔滨150001)

卵巢癌病死率在女性恶性肿瘤中排第5位。最新数据显示，全球每年新增卵巢癌确诊病例225 500例，病死率高达62%。尽管激素替代疗法的改变使得卵巢癌发病率有所下降，但该病诊断及治疗研究并未取得显著进展。N-myc下游调节基因家族(NDRGs)有4个成员，即NDRG1、NDRG2、NDRG3、NDRG4。这些家族成员在正常的脑组织、心脏组织、骨骼肌组织中呈高表达[1]。NDRG4作为癌症相关基因，被认为参与了癌症的发生发展，但是在各种癌症中发挥的作用可能不同。在结肠癌中NDRG4被认为扮演抑癌基因角色，可抑制结肠癌细胞的增殖和转移[2]；而在恶性脑膜瘤中NDRG4则具有促进肿瘤细胞迁移和侵袭的作用[3]。本课题组前期研究表明，NDRG4在卵巢癌组织中低表达[4]，但关于NDRG4基因在卵巢癌发生发展中的具体作用目前报道较少。SKOV3是一种顺铂耐药的人卵巢癌腺癌细胞系，HO8910是一种高转移性人卵巢癌腺癌细胞系，两种细胞系是卵巢癌基础研究中最常用的细胞模型。2017年6月～2018年10月，我们观察了下调NDRG4表达后SKOV3、HO8910细胞增殖和凋亡的变化，初步探讨NDRG4在卵巢癌发生和发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要实验材料 SKOV3、HO8910细胞由黑龙江转化医学中心馈赠，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基、5% CO2、37 ℃的细胞孵箱内常规培养，当细胞融合度达80%时进行传代。RPMI1640培养基购于Hyclone公司,胎牛血清购于杭州四季青公司。细胞消化胰酶、BCA试剂盒购自碧云天公司,Opti-MEM培养基、Lipo2000购自Invitrogen公司。NDRG4、Bcl-2、Bax、P38/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p-P38/MAPK一抗购自Abcam公司,β-actin抗体购于CST公司。

1.2 细胞分组、转染及NDRG4检测 将SKOV3细胞、HO8910细胞各分为转染组和对照组。两组均于细胞融合度达60%时进行转染。转染组细胞转染siRNA-NDRG4，序列为5′-CAAACTATGCTTCAACACCTT-3′；对照组细胞转染无意义空白siRNA(siNc)，序列为5′-CGACGTAAACGGCCACAAGTT-3′。按试剂说明要求，将siRNA、Opti-MEM及Lipo2000混合物加入不含血清的RPMI1640培养基中，6 h后更换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。转染72 h后，采用Western blotting法检测细胞中的NDRG4蛋白：加入RIPA蛋白裂解液，常规提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度；蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳后，转至PVDF膜上，羊奶粉封闭；4 ℃下加一抗NDRG4(1∶800)、β-actin(1∶1 000)孵育过夜；PBST漂洗PVDF膜后，置于室温下加二抗孵育1 h，再次用PBST漂洗；化学发光法检测目的蛋白表达强度。结果显示，转染组SKOV3、HO8910细胞中NDRG4蛋白表达水平(分别为0.243±0.022、0.182±0.019)显著低于对照组(分别为0.523±0.031、0.423±0.072)。见图1。证明所用siRNA-NDRG4序列有效，可以用于后续实验。

图1 转染组和对照组SKOV3、HO8910细胞中NDRG4表达情况(Western blotting法)

1.3 细胞增殖能力观察 分别于转染后0、24、48、72 h检测细胞增殖能力。将转染组和对照组SKOV3、HO8910细胞以1×103/孔接种于96孔板中，在某固定时间处理同一培养板，在每孔中加入20 μL的MTT，37 ℃细胞培养箱中孵育4 h后每孔加入150 μL的二甲基亚砜，用酶联免疫仪于490 mm波长处测吸光度值表示细胞增殖能力，制作细胞增殖曲线。所有实验重复3次。

1.4 细胞凋亡情况观察 将转染组和对照组SKOV3、HO8910细胞接种于6孔板，常规转染48 h后用胰酶消化细胞，离心并收集沉淀，加入5 μL的AnnexinV-FITC和5 μL的碘化丙啶避光孵育15 min，采用流式细胞仪观察细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率。所有实验重复3次。

1.5 细胞凋亡相关蛋白及P38/MAPK通路相关蛋白检测 在两组细胞中加入RIPA蛋白裂解液，常规提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳后，转至PVDF膜上，羊奶粉封闭；4 ℃下加一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、p-P38/MAPK(1∶800)、P38/MAPK(1∶800)、β-actin(1∶1 000)孵育过夜；PBST漂洗PVDF膜后，置于室温下加二抗(1∶10 000)孵育1 h，再次用PBST漂洗；化学发光法检测目的蛋白(Bcl-2、Bax、p-P38/MAPK、P38/MAPK)表达强度。所有实验重复3次。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 转染组和对照组SKOV3、HO8910细胞转染后24 h细胞增殖能力差异无统计学意义。转染组SKOV3细胞转染后48、72 h增殖能力(分别为1.226±0.121、1.483±0.050)高于对照组(分别为0.880±0.061、1.103±0.070)，P分别为0.011、0.001；转染组HO8910细胞转染后48、72 h增殖能力(分别为1.020±0.107、1.303±0.241)高于对照组(分别为0.800±0.070、0.980±0.060)，P分别为0.034、0.002。

2.2 两组细胞凋亡率比较 转染组SKOV3细胞早期凋亡率为23.20%±4.41%、晚期凋亡率为8.40%±2.21%，均低于对照组的28.72%±3.21%、14.12%±3.81%(P分别为0.032、0.021)；转染组HO8910细胞早期凋亡率为24.10%±5.82%，晚期凋亡率为9.40%±3.12%，均低于对照组的30.22%±6.12%、15.21%±4.92%(P分别为0.012、0.045)。

2.3 两组细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达比较 转染组、对照组SKOV3细胞中Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.624±0.212、0.212±0.049，Bax蛋白相对表达量分别为0.341±0.105、0.751±0.172；转染组、对照组HO8910细胞中Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.275±0.041、0.143±0.009，Bax蛋白相对表达量分别为0.314±0.021、0.599±0.064。转染组SKOV3、HO8910细胞中Bcl-2蛋白相对表达量较对照组增高，Bax蛋白相对表达量较对照组降低(P均<0.05)。见图2。

图2 两组SKOV3、HO8910细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达情况(Western blotting法)

2.4 两组细胞中P38/MAPK通路相关蛋白表达比较 转染组、对照组SKOV3细胞中p-P38/MAPK相对表达量分别为0.149±0.014；0.227±0.073；P38/MAPK相对表达量分别为0.545±0.081、0.604±0.068；转染组、对照组HO8910细胞中p-P38/MAPK相对表达量分别为0.281±0.004、0.682±0.051，P38/MAPK相对表达量分别为0.615±0.034、0.657±0.054。转染组SKOV3、HO8910细胞中p-P38/MAPK相对表达量低于相应对照组(P均<0.05)。见图3。

3 讨论

NDRG4位于人染色体16q21，在各种癌症的发生进展中发挥不同作用[5，6]。在结直肠癌中NDRG4被证明是一个抑癌基因，可以影响PI3K/AKT信号通路的活性；因此，粪便标本NDRG4检测有望成为诊断早期结直肠癌的方法[7]。在脑胶质瘤中，NDRG4表达明显下降，并与患者的预后相关[8]。在胃癌中，NDRG4启动子甲基化水平与患者预后相关[9]。

图3 两组SKOV3、HO8910细胞中P38/MAPK、p-P38/MAPK表达情况(Western blotting法)

由于卵巢在盆腔的位置较深，绝大部分卵巢癌患者就诊时已处于中晚期，伴随有广泛的盆腔、腹腔转移，患者5年生存率不足30%，寻找有效的卵巢癌治疗新靶点势在必行[10]。NDRG4在多种癌症中被认为与肿瘤细胞增殖能力相关[11，12]。本课题组前期研究发现，对比正常卵巢组织，卵巢癌组织中NDRG4的表达显著降低，并且与卵巢癌的分化程度和病理分期相关[4]。本研究观察了NDRG4对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其相关的分子生物学机制。我们应用siRNA下调了人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910中NDRG4的表达水平，发现下调了NDRG4表达的卵巢癌细胞增殖能力明显上升，提示在卵巢癌中NDRG4具有抑制细胞增殖的作用。

细胞凋亡与癌症的发生发展密切相关，这一生物学过程受到多种基因的影响。Bcl-2家族是研究最多的一类凋亡相关蛋白，包含了Bcl-2、Bax等。大量研究表明，Bcl-2家族可以通过多种途径影响细胞凋亡，包括与线粒体的相互作用、与凋亡家族其他蛋白的相互作用等[13,14]。本研究结果显示，抑制NDRG4表达后，卵巢癌细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率明显下降，Bcl-2表达水平增高而Bax表达水平下降，表明在卵巢癌中NDRG4可以诱导细胞凋亡。细胞凋亡分为内源性凋亡和外源性凋亡。外源性细胞凋亡包括对下游Fas、DR4、DR5等蛋白的调控，而内源性细胞凋亡则可导致包括线粒体膜结构不稳定、细胞色素C释放、Caspase相关蛋白和Bcl-2家族蛋白表达水平的改变[15,16]。在内源性细胞凋亡途径中，位于线粒体膜外的Bax蛋白转移，可加强细胞色素C的外流，进而诱发内源性凋亡的瀑布式启动[17]。本研究结果提示NDRG4所诱发的卵巢癌细胞凋亡有部分是通过Bcl-2家族蛋白调节的内源性细胞凋亡来实现的。NDRG家族诱导细胞凋亡在多种恶性肿瘤相关研究中被报道过。Liu等[18]研究显示，下调NDRG2表达后可抑制p53介导的细胞凋亡。在星形胶质细胞瘤中下调p53的表达可导致NDRG2表达下调，NDRG2可作为p53诱导凋亡的一个相关调节基因[19]。

MAPK是一组重要的丝/苏氨酸蛋白激酶，参与多种癌症的调节过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应等。MAPK细胞信号通路可以分为细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路、P38通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路及细胞外信号调节激酶5(ERK5)通路。在卵巢癌相关研究中涉及最多的是P38/MAPK通路，该通路被认为广泛参与卵巢癌发生发展过程。WAVE3作为癌基因，可通过作用于P38/MAPK细胞信号通路促进卵巢癌细胞增殖[20]。Feng等[21]研究表明，Wip1对卵巢癌细胞凋亡的影响与调节P38/MAPK信号通路活性有关。本研究结果显示，转染组SKOV3、HO8910细胞中p-P38/MAPK相对表达量低于相应对照组，提示NDRG4对卵巢癌细胞增殖和凋亡的作用可能是通过调节P38/MAPK信号通路活性实现的。

综上所述，NDRG4表达下调后卵巢癌细胞增殖能力增高、凋亡减少，其机制可能与调节Bcl-2/Bax表达及P38/MAPK信号通路活性有关，更加详细的分子生物学机制有待于进一步探讨。