多花黑麦草对磷胁迫的响应及耐磷指标的筛选

徐彦红 李斌 席溢 许钟丹 左意才

摘要：对不同供磷水平下多花黑麦草（Lolium multiflorum）生长初期生长特性的变化进行分析，筛选耐磷指标，为多花黑麦草耐磷机制的研究和生产实践提供基础理论依据。利用主成分分析和模糊数学隶属函数分析6个不同供磷水平（0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/kg）对多花黑麦草生长特性的影响并进行综合评价;用株高、叶宽、叶绿素a含量等8个指标的耐磷系数和综合评价值（D）进行灰色关联分析。结果表明，随着磷水平的增加，株高、叶宽、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、脯氨酸含量呈现先上升后下降的趋势，丙二醛含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性呈现先下降后上升的趋势;多花黑麦草最适生长的磷水平为10.0 mg/kg;与耐磷性最相关的指标为超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量、株高、叶绿素a含量。

关键词：多花黑麦草;磷胁迫;主成分分析;隶属函数;灰色关联分析

中图分类号： Q945.78;S543+.601  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0176-05

多花黑麦草（Lolium multiflorum）为一年生（越年生）禾本科牧草，具有产量高、品质高、适于饲喂等优点。大力发展多花黑麦草种植，能有效缓解人畜争粮问题，促进节粮型畜牧业发展，并能发挥其生态功能。磷是植物生长的必需营养元素，同时也是土壤中普遍缺乏的元素。喀斯特地区土壤瘠薄，保水保肥能力差，且贵州省气候温暖，雨量充沛[1]，是极易造成营养元素淋溶流失的地区之一。因此，探讨磷素对多花黑麦草生长特性的影响，确定其适宜种植的磷水平、筛选其耐磷指标对指导多花黑麦草生产种植和研究多花黑麦草耐磷机制有重要意义。

植物各生长指标对营养元素的响应差异较大，仅用单项指标来反映植物对某一营养元素的响应效果局限性较大。因此，探讨元素对植物的处理效果，应用尽可能多的指标来综合评定，从而可以减少单项指标对处理效果评价所造成的片面性。此外，目前关于植物耐磷指标筛选的研究较少[2]，多集中于抗旱、耐盐等指标的筛选[3-7]，关于多花黑麦草耐磷指标筛选的研究也较少。因此，设置不同的供磷水平，研究其对多花黑麦草形态和生理指标的影响，利用主成分分析和模糊数学隶属函数法对各指标进行综合评价，旨在确定多花黑麦草适合生长的磷水平，为多花黑麦草的种植提供理论依据;用灰色关联分析法对株高、叶宽、叶绿素a含量等8个指标进行排序，旨在为耐磷指标的筛选提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2017年3月开始，在贵州大学南校区校内进行。

1.2 试验设计

以多花黑麦草安格斯1号为材料，采用砂培法进行种植。

石英砂用水浸泡，除去黏土和有机质，至洗涤的水呈无色透明为止;再用3%盐酸浸泡7 d;然后用霍格兰营养液浸泡，每天2次，至pH值稳定为止。将处理好的石英砂装入直径29.5 cm、深21.5 cm的花盆中，每盆装9.0 kg。

挑选均匀饱满的黑麦草种子，将其置于2% H2O2溶液中浸泡10 min进行消毒，再用蒸馏水冲洗6遍，晾干备用，将处理后的种子置床培养。待种子发芽，苗长7 cm以上时，选择高度近似、生长情况相近的幼苗移栽花盆中，移栽深度为 2 cm。为确保植株有足够的养分，每周定期为植株浇灌霍格兰营养液。

共设置6个磷水平（0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/kg），分别用CK、P2.5、P5.0、P10.0、P25.0、P50.0表示，磷源为NaH2PO4，试验开始时溶解在水中，施入石英砂中。每个磷水平有3盆重复，每盆定苗3株黑麦草。

1.3 指标测定

从3月31号开始，每周测量1次株高和最宽叶宽，直到4月底结束。收割多花黑麦草，测定其他生理指标。

光合色素的测定参照高俊凤的方法[8];丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法;脯氨酸（Pro）含量的测定采用酸性茚三酮法[9];超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法[10]。

1.4 数据处理与分析

根据所得数据，求各指标的相对值，具体见公式（1）。加权隶属函数相关公式见式（2）～式（5）。

各指标相对值（X）=磷处理各指标测定值对照各指标测定值;

利用Excel 13.0軟件整理数据和绘制图像，SPSS 19.0软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 不同磷水平处理对多花黑麦草形态的影响

株高和叶宽是反映禾本科植物生物性状的重要指标。由表1可知，在3月31日、4月21日和4月28日时，各磷水平处理对株高的影响没有显著性差异;随着磷水平的增加，株高整体呈现先增加后降低的趋势;在4月21日时，磷水平为5、10 mg/kg时，株高相对较高;同一磷水平处理，生长后期株高显著高于生长前期（P<0.05），如P50.0处理在4月28日、4月21日所测株高显著高于4月14日、4月7日和3月31日。

由表2可知，不同磷水平处理在同一时间和同一磷水平处理在不同时间对叶宽的影响差异都显著。总体来说，磷水平5、10 mg/kg对叶宽的促进作用最显著。

2.2 不同磷水平处理对多花黑麦草生理特性的影响

从图1可知，磷水平为2.5 mg/kg，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均为最高，显著高于对照及其他处理，与其他处理间存在显著性差异（P<0.05）;随着磷水平的增加，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量整体呈现出先上升后下降的趋势。

从图2可知，磷水平为50.0 mg/kg时，丙二醛含量与对照组相比没有显著性差异（P>0.05），但显著高于其他处理。

由图3可知，磷水平为5.0 mg/kg时，脯氨酸含量最高，与磷水平为10.0 mg/kg时相比没有显著性差异（P>0.05），但均高于其他处理。在磷水平为<5.0 mg/kg时，脯氨酸含量呈现上升的趋势。

从图4可知，磷水平为25.0 mg/kg时，超氧化物歧化酶活性最大，显著大于磷水平为2.5、50.0 mg/kg时的活性（P<0.05）。当磷水平为5.0～25.0 mg/kg时，随着磷水平的增加，超氧化物歧化酶活性增强。

2.3 不同磷水平处理对多花黑麦草生长特性的综合评价

不同磷水平处理对多花黑麦草8个评价指标（株高、叶宽、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性，其相对值分别用X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8表示）的影响存在不一致性（表3），仅利用单一指标评价不同磷水平处理对多花黑麦草的影响存在片面性。因此，通过对所有评价指标进行系统分析，筛选出最合适的综合指标是十分必要的。对8个评价指标进行相关性分析发现，有些评价指标间相关性显著或极显著（表4），如X5与X3之间相关性极显著（r=0.978，P<0.01），可认为X5与X3的耐磷性共同信息量为97.8%，且其余具有相关性的评价指标间也存在信息重叠现象。因此，筛选出既能有效代表所有单项评价指标，又彼此独立且没有信息重叠的综合指标来评价多花黑麦草对磷的胁迫响应是十分必要的。

对8个评价指标进行主成分分析，结果如表5所示。根据特征值大于1及累积贡献率大于85%的原则，选取前2个主成分作为综合指标，可有效反映8个评价指标87.332%的信息。在第1主成分（PC1）中，X1、X2、X3、X5、X7、X8指标的构成载荷较大;在第2主成分（PC2）中，X4、X6指标的构成载荷较大。可见上述鉴定指标与多花黑麦草的耐磷性存在一定关系。利用2个综合指标的特征向量建立综合指标与原单项指标的线性组合方程，见式（9）～式（10）。

根据各指标的相对值（表3）和综合指标的线性组合方程，得到综合指标的值，根据式（2）～式（5）计算多花黑麦草2个综合指标的隶属函数值U（Zj）、权重和综合评价值（D），结果见表6。根据D的大小，评价不同磷水平对多花黑麦草的影响效果为P10.0>P5.0>P2.5>P50.0>P25.0。在磷水平为10.0 mg/kg时，隶属函数值最高，从前面的分析中也可以看出，除了丙二醛含量较低外，其余各项指标均比较适宜，综合考虑多花黑麦草最适宜种植的磷水平为10.0 mg/kg。

2.4 多花黑麦草生长初期耐磷指标的筛选

按灰色系统理论要求，将D和8个指标视为一个整体。数据进行标准化处理，根据关联分析四公理[11]，计算各指标与D的关联系数，然后分别求出各指标与D的关联度，并按关联度大小排列出关联序。

以D为参考数据列X0=（0.046，0.305，0.363，0.000，0.041），株高等8项指标为比较数列（子序列），记为Xi（i=1，2，3…，8），X1=（0.99，1.13，1.10，1.04，1.01）、X2=（102，1.57，1.64，1.38，1.45）、…、X8=（1.48，2.72，2.66，1.51，2.16）。使用式（5）对数据进行标准化处理[12]，使用式（6）～式（7）计算关联系数、关联度，如表7所示。

关联度的大小表示某一项指标对磷的耐受强度。根据表7的结果，各项指标对磷的耐受强度排序为超氧化物歧化酶活性>脯氨酸含量>株高>叶绿素a含量>叶宽>丙二醛含量>类胡萝卜素含量>叶绿素b含量。

3 讨论

3.1 不同磷水平处理对多花黑麦草生长的影响

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，不仅是植物体内许多重要化合物的组分，而且还以多种途径参与植物代谢[13]。植物细胞抵抗逆境损伤的重要保护酶系统如SOD和过氧化物酶（POD）等是植物体内活性氧的清道夫，在清除植株体内多余的活性氧、避免细胞受到氧损伤等过程中发挥着巨大的作用[14]。不同的磷水平处理对植物的生长指标和生理指标有较大的差异，随着磷水平的增加，株高呈现先上升后下降的趋势，与董秋平等的研究结果[14]有相似性。本研究中随着磷水平的增加，多花黑麦草的叶绿素含量下降，该结果与前人对类芦、玉米和桉树的研究结果[12，15-16]不一致。与之相反，陈秀铃研究发现，邓恩桉叶片叶绿素含量在低磷肋迫下显著增加[17]，与本研究结果一致，这说明不同的植物对磷处理的应答具有一定的差异，植物可通过自身调节叶绿素含量来适应。此外，本研究中，随着磷水平的增加，叶绿素a、叶绿素b、脯氨酸含量呈現先上升后下降的趋势，超氧化物歧化酶活性呈现先下降后上升的趋势，该结果与余姣妲等对杉木的研究结果[18]有相似之处，也有所差别，这表明在磷胁迫下，不同植物的适应机制有差异性。

3.2 不同磷水平处理对多花黑麦草影响的综合评价及耐磷指标的筛选

关于植物耐磷的形态及生理指标有很多，笔者选取8个指标用于多花黑麦草对不同磷水平处理效果响应的评价。通过主成分分析可将8个原始的单项指标转换成2个新的相对独立的综合指标，进一步对2个新的综合指标利用隶属函数分析法得到耐磷综合评价值，避免了利用单个性状指标描述多花黑麦草对磷响应的局限性。张加强等运用灰色关联分析筛选出亚麻芽期的耐镉鉴定指标[19];苏德伟等运用灰色关联分析得出叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量、可溶性多糖含量与抗旱指数的关联度较大[20];崔博文等运用灰色关联分析得出类胡萝卜素质量分数、根系活力、丙二醛质量分数和游离脯氨酸质量分数与马尾松耐低磷性关系密切[21]，此法在数据分析上已得到广泛应用[22-24]。本试验在主成分分析和隶属函数分析的基础上，利用这8个与耐磷性密切相关的形态及生理指标与耐磷综合评价值进行灰色关联分析，筛选出超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量、株高、叶绿素a含量与综合评价值的关联度最大，可作为反映多花黑麦草对磷响应效果的分析指标。由于本试验仅涉及1个多花黑麦草品种对磷的生理响应的研究，筛选出的耐磷指标存在一定的局限性，因此，还需进一步研究不同品种多花黑麦草对磷的生理响应，从而筛选出更具有代表性的耐磷指标。

4 结论

在一定的磷水平范围内，磷水平的增加对多花黑麦草的生长有促进作用，多花黑麦草各指标对磷的耐受水平也不同。通过主成分分析和隶属函数法对多花黑麦草8个鉴定指标的耐磷系数进行综合评价得出，磷水平10.0 mg/kg时最适宜多花黑麦草生长;灰色关联相关分析结果表明，在综合评价值和各耐磷指标的关联度中，超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量、株高、叶绿素a含量与综合评价值的关联度较大，可作为多花黑麦草耐磷评价指标。

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