寒富苹果采收及贮藏期间果面真菌的检测分析

周恩达，陈 瑶，吕德国，秦嗣军

（沈阳农业大学 园艺学院，沈阳 110161）

目前，我国果品腐烂损失率高达23%～30%[1]，微生物侵染是造成果品腐烂的主要因素之一，其中以真菌造成的病害种类最多，约占全部病害的70%～80%[2]。 病原真菌不仅在田间生产过程中直接侵染发病，还能在采后贮藏及运输过程中潜伏侵染发病[3]。 真菌性病害不仅会造成水果采后大量损失，还会在果品生产、采收、贮藏和运输过程的各个环节产生有害次生代谢物，进而危害人体健康。 控制贮藏条件是苹果生产的重要环节，苹果贮藏方式主要有简易贮藏和设施贮藏两种，简易贮藏有沟埋藏、堆藏、窖藏等，设施贮藏有通风库贮藏、冷库贮藏和气调库贮藏等。 引起果品采后及贮藏期严重病害的病原菌主要来自于链格孢属 （Alternaria）、 镰刀菌属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）、盘长孢属（Gloeosporium）、链核盘菌属（Monilinia）、青霉属（Penicillium）、葡萄孢属（Botrytis）、地丝菌属（Geotrichum）、根霉属（Rhizopus）、毛霉属（Mucor）等[4]。 其中由扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病往往是苹果采后最普遍的病害，因其产生的展青霉素对人类健康具有潜在致癌性而受到广泛关注[5-6]。 炭疽病也是采前和采后常见病害，特别是在高温高湿的环境条件下，且果园没有喷施有效植物保护剂的情况下，可以造成50%～80%的苹果产量损失[3]。 苹果微生物的相关研究主要集中于生长季芽、果实和叶面的真菌区系[7-8]，或施用不同化学和生物防护制剂对果树微生物区系的响应，而对于采后果实表面真菌微生物的研究相对较少[9]。 沈阳地区为苹果新兴产区，果农普遍缺乏果实病害防控相关的知识与经验，果实采后损失较重。 本研究分析了沈阳不同地区果园套袋与未套袋寒富苹果在采收期和贮藏期果实表面真菌种群及数量差异，以期理清影响采后损失的关键微生物因素，为提出相应的防护措施以降低采后损耗、增加果园经济效益，以及制定寒富苹果采后及贮藏技术规程提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试寒富苹果（Malus domestica Hanfu）取自沈阳农业大学果树栽培与生理生态团队近年来在沈阳各地建立的试验及生产示范园，包括沈阳农业大学校内教学科研基地、浑南区李相街道、新民市梁山镇和公主屯镇、康平县西关镇、法库县慈恩寺乡、沈北新区清水台镇、苏家屯区沙河街道及辽中区牛心坨镇的寒富苹果生产示范园。 为方便描述，分别简称为农大示范园、浑南区示范园、新民市（梁山镇）示范园、新民市（公主屯镇）示范园、康平县示范园、法库县示范园、沈北新区示范园、苏家屯区示范园及辽中区示范园。 其中，农大示范园、浑南区示范园、新民市（梁山镇）示范园、康平县示范园和法库县示范园的样品果又设套袋和未套袋2 个处理。 样品合计14 份，包括9 份套袋样品果和5 份未套袋样品果。 各处理随机选取大小均匀、品质良好、无病虫害的样品果60 个备用。

供试孟加拉红培养基组分为蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂15.5g、孟加拉红0.05g、氯霉素 0.1g、蒸馏水 1L、pH 值（7.2±0.2）。 PDA 培养基组分为马铃薯 200g、葡萄糖 20g、琼脂 20g、蒸馏水1L、pH 值自然。 DNA 提取试剂盒为康为世纪公司基因组DNA 提取试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 寒富苹果采收期果面的真菌调查 从各处理备用样品果中随机选取1 个果实，将其放入无菌自封袋中，加200mL 无菌生理盐水（0.9%NaCl 溶液）完全浸入，超声波震荡30min，取25mL 洗液于无菌离心管中，作为微生物原液，重复3 次。 利用梯度浓度稀释法对微生物原液进行10-1，10-2，10-3稀释。

1.2.2 土窖和冷库贮藏期间苹果果面的真菌调查 从沈阳农业大学教学科研基地果园套袋处理的60 个备用样品果中随机取20 个果实，各取10 个分别置于沈阳农业大学果树栽培与生理生态团队的机械冷库（贮藏温度为-1～4℃）和浑南区示范园园主张桂华自建的土窖（冬季最低贮藏温度为-2℃）中贮藏，于2014年11月28日、12月28日及2015年1月28日按1.2.1 步骤进行果面真菌分析。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 微生物计数 真菌计数采用孟加拉红培养基。分别取3 个浓度的稀释液各1mL 于计数培养基内，重复2 次。悬液的接种方法采用玻璃珠摇匀法。 培养3d，以3～30 个菌落的平板为适宜稀释浓度进行计数。

1.3.2 优势菌落的分离纯化 真菌分离纯化采用PDA 培养基。从最高稀释度平板上出现形态不相同的菌落的培养基中选挑菌落数在3～10 的菌落，分离纯化培养。

1.3.3 真菌形态观察 参照《真菌的形态与分类》[10]，描述真菌在PDA 培养基平板上的菌落形态，并采用直接挑取压片法制片，进行真菌的显微结构观察，记录菌丝、孢子囊、孢子梗及孢子形态等。

1.3.4 真菌rDNA-ITS序列分析用DNA 提取试剂盒提取经过纯化培养的真菌DNA。 利用真菌分子鉴定通用引物ITS1 和ITS4 对苹果果实表面优势真菌rDNA 上的ITS 区域进行PCR 扩增。 反应体系和反应过程参考孙鑫垚方法[11]。 PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往华大生物工程有限公司完成测序。 获得的rDNA-ITS 序列利用GenBank 数据库BLAST 程序搜索同源序列，结合真菌的形态特征进行真菌鉴定。

1.3.5 数据统计分析 定植率（Isolation rate）可以反应一个特定真菌菌属在各处理中的侵染程度。 相对频度（Relative frequency）能够表示一个特定真菌菌属的出现频率。 其计算公式为：

1.3.6 致病性检测 采用创伤接种法， 用于接种的苹果为健康的套袋寒富苹果， 将待处理的每个苹果浸入70%乙醇做表面消毒，随后用灭菌水冲洗，在紫外灯下照射1h。 用打孔器在苹果上相同的位置打孔，每个苹果打两个孔，直径0.3cm，挑取经过纯化的真菌菌丝少许，接种在创口处，保鲜膜保湿；对照处理注入无菌水。 25℃培养，3d 后观察发病情况，然后每隔1d观察1 次，至接种后30d。

2 结果与分析

2.1 寒富苹果采收期和贮藏期果面真菌数量分析

2.1.1 寒富苹果采收期果面的真菌数量分析 由表1 可知， 沈阳地区果园寒富苹果采收期果面真菌数量最少的是康平县示范园套袋处理（21.03CFU·cm-2），最多的是法库县示范园未套袋处理（79.76CFU·cm-2）。 套袋处理中，各果园样品果表面真菌数量顺序为康平县示范园＜浑南区示范园＜新民市（梁山镇）示范园＜农大示范园＜辽中区示范园＜法库县示范园＜新民市（公主屯镇）示范园＜沈北新区示范园＜苏家屯区示范园。 未套袋处理顺序为新民市梁山示范园＜浑南区示范园＜康平县示范园＜农大示范园＜梁山示范园。 套袋对比试验中，各示范园套袋处理的苹果表面真菌数量均小于未套袋处理。

2.1.2 寒富苹果贮藏期苹果表面真菌数量分析 由图1 可知， 土窖贮藏苹果果面的真菌数量随贮藏期延长呈先减少后迅速增加的趋势， 在11月28日真菌数量最低为4.42CFU·cm-2，随后迅速增加，在1月28日达到197.32CFU·cm-2； 而冷库贮藏苹果果面的真菌数量随贮藏期延长呈先降低后升高再稳定的趋势， 在 11月28日真菌数量最低为 20.05CFU·cm-2，之后逐渐增加，至 12月28日增至125.74CFU·cm-2，随后真菌数量相对稳定，直至1月28日真菌数量为125CFU·cm-2。

2.2 寒富苹果采收期和贮藏期果面优势真菌菌落分离、鉴定与致病性检测

图1 贮藏期不同贮藏条件下果面真菌数量变化Figure 1 The change of fungus numbers on fruit surface in different storage methods

2.2.1 寒富苹果采收期和贮藏期果面优势真菌菌落分离鉴定 根据从果面分离纯化出的优势真菌在生长过程中表现出的不同性状， 从沈阳地区9 个果园的寒富苹果采收期和贮藏期果面共分离纯化出100 个真菌菌株，经形态学观察初步鉴定为29 种优势真菌（编号依序命名为A～X、LA、LB、TA、TE 和TG）。

2.2.2 寒富苹果采收期和贮藏期果面优势真菌菌落ITS 鉴定 通过rDNA-ITS 序列鉴定，经PCR 扩增产物电泳得到的片段大小为500～750bp（图2），发现形态学观察所得到的29 种优势真菌属于2 个门，子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）。 结合真菌形态学和rDNA-ITS 序列分析鉴定，分为10 个属：青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、茎点霉属（Phoma）、链格孢属（Alternaria）、枝孢属（Cladosporium）、毛霉属（Mucor）、木霉属（Trichoderma）、短梗霉属（Aureobasidium）、蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium）和赤霉菌属（Gibberella）。 其中 9 个属于子囊菌门，1 个属于接合菌门。

图2 采收期和贮藏期寒富苹果表面优势真菌ITS 序列PCR 扩增产物电泳图谱Figure 2 Electrophoresis picture of PCR extended products

2.2.3 寒富苹果采收期果面优势真菌致病性检测 通过观察记录真菌侵染致病情况，确定29 种优势真菌的致病性。 接种 30d 后真菌 A、E、F、I、K、L 和 LB 接种的果面仍未出现任何变化，确定这 7 种真菌没有致病性。 其余22 种真菌在30d 内表现出不同的病症和侵染强度，致病比例高达75.86%。22 种致病菌中有16 种于接种3d 后开始出现病症，有11 种于接种30d 后引起一半以上果实腐烂。青霉属、曲霉属、链格孢属、毛霉属和木霉属致病性强，蜡蚧轮枝菌和赤霉菌属致病性相对较弱，枝孢属、短梗霉属无致病性。

2.2.4 寒富苹果采收期和贮藏期优势真菌菌落分析 由表2 可知， 从沈阳地区9 个苹果园采收期样品果表面共分离出66 个真菌菌株，经形态学观察得到24 种优势真菌，结合rDNA-ITS 序列鉴定出它们属于2 个门（子囊菌门、 接合菌门），4 个纲 [座囊菌纲 （Dothideomycetes）、 粪壳菌纲 （Sordariomycetes）、 散囊菌纲（Euro-tiomycetes）、毛霉纲（Mucormycotina）]，6 个目[格孢腔菌目（Dothideales）、煤炱目（Pleosporales）、座囊菌目（Capnodiales）、肉座菌 目（Hypocreales）、散囊菌目 （Eurotiales）、毛霉目（Mucorales）]，9 个 科[小穴壳菌科（Dothioraceae）、格孢腔菌科（Pleosporaceae）、假煤炱科（Davidiellaceae）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae）、丛赤壳科（Nectriaceae）、肉 座菌科（Hypocreaceae）、虫 草 菌科（Cordycipitaceae）、发 菌 科 （Trichocomaceae）、毛 霉 科 （Mucoraceae）]，10 个属（短梗霉属、茎点霉属、链格孢属、枝孢属、赤霉菌属、木霉属、蜡蚧轮枝菌、曲霉属、青霉属和毛霉属）。其中套袋处理有43 个果面优势菌株，形态学观察分属22 种优势真菌，来自于以上10 个属；其中青霉属14 个、曲霉属 10 个、茎点霉属 4 个、链格孢属 2 个、枝孢属 3 个、毛霉属 2 个、木霉属 3 个、短梗霉属 1 个、蜡蚧轮枝菌3 个、赤霉菌属1 个。 不套袋处理有23 个果面优势菌株，分属13 种优势真菌，来自于7 个属；其中青霉属6 个、曲霉属5 个、茎点霉属5 个、枝孢属1 个、毛霉属2 个、木霉属3 个、蜡蚧轮枝菌1 个，与套袋处理相比没有链格孢属、短梗霉属和赤霉菌属。

表2 寒富苹果采收期果面优势真菌菌落Table 2 Advantage fungal colony on Hanfu harvest

由表3 可知，采收期各处理果面优势真菌中以青霉属的定植率和相对频度最高，分别为92.86%和30.16%，其次为曲霉属、茎点霉属、木霉属和毛霉属，短梗霉属和赤霉菌属的定植率和相对频度最低，均为7.14%和1.59%。在5 个套袋和未套袋对比处理示范园中，套袋处理没有赤霉菌属，其他真菌的定植率和相对频度与全部处理的排序相同；未套袋处理定植率以青霉属最高，高达100%，其次为茎点霉属、曲霉属、木霉属和毛霉属，而相对频度以曲霉属最高，为17.78%，其次为青霉属和茎点霉属，没有链格孢属、短梗霉属和赤霉菌属。

综上，果实表面以青霉属真菌的定植率最高，套袋处理果面以青霉菌相对频度最高，而未套袋处理果面以曲霉属真菌相对频度最高。 套袋处理果面优势真菌的菌属种类多于未套袋处理。

表3 采收期果面优势真菌的定植率和相对频度Table 3 The isolation rate and relative frequency of advantage fungal colony on fruit surface in harvest

由表4 可知，贮藏期土窖贮藏处理共分离出19 个果面优势真菌菌落，形态学观察分属14 种优势真菌，属于2 个门（子囊菌门、接合菌门），4 个纲（座囊菌纲、粪壳菌纲、散囊菌纲、毛霉纲），5 个目（煤炱目、座囊菌目、肉座菌目、散囊菌目和毛霉目），5 个科（假煤炱科、丛赤壳科、虫草菌科、发菌科和毛霉科），8 个属（青霉属、曲霉属、茎点霉属、链格孢属、枝孢属、毛霉属、蜡蚧轮枝菌和赤霉菌属）。 其中青霉属7 个、曲霉属5 个、茎点霉属2个、链格孢属1 个、枝孢属1 个、毛霉属1 个、蜡蚧轮枝菌1 个和赤霉菌属1 个。

表4 土窖贮藏条件下苹果表面优势真菌菌落Table 4 Advantage fungal colony on apple surface in cellar

由表5 可知，贮藏期冷库贮藏处理共分离出15 个果面优势真菌菌落，形态学观察分属10 种优势真菌，均属子囊菌门，2 个纲（座囊菌纲、散囊菌纲），3 个目（煤炱目、座囊菌目、散囊菌目），2 个科（假煤炱科、发菌科），5个属（青霉属、曲霉属、茎点霉属、链格孢属和枝孢属）。 其中青霉属3 个、曲霉属5 个、茎点霉属3 个、链格孢属2 个和枝孢属2 个。

表5 冷库贮藏条件下苹果表面优势真菌菌落Table 5 Advantage fungal colony on apple surface in refrigerator

综上，贮藏期两种贮藏处理下共分离出34 个果面优势真菌菌落，形态学观察分属17 种优势真菌，来自于8 个属，且土窖贮藏处理在菌落数和菌属种类上均高于冷库贮藏处理。 毛霉属、蜡蚧轮枝菌和赤霉菌属为土窖贮藏特有菌属。

3 讨论与结论

苹果常见真菌病害主要有炭疽病、轮纹病、白粉病、腐烂病和黑点病等[2]，主要由子囊菌属[12]、柱盘孢属或茎点菌属引起[13]。 沈阳不同地区寒富苹果园采收期果实表面的真菌数量差异较大，这与果农用药种类和数量有关，如用多菌灵等苯并咪唑类农药防治苹果炭疽病[14]，用三唑类杀菌剂防止白粉病[15]。 果园一般于4月中旬开始喷第一遍清园防病药剂，进入生长季后根据病害种类及气候条件等具体情况决定打药种类、次数及时间等。果实套袋能避免果实与外界环境的直接接触，有效减轻了雨传病害和蛀果害虫的发生，提高果实表皮光洁度、促进果实着色、降低农药残留、减少机械和人为损伤[16-18]，有效提高果品品质。 然而，有研究表明果实套袋能明显改变果面真菌的种群结构、且不同时期和不同果袋种类差异显著[19]。本试验5 个示范果园套袋和未套袋的对比处理中，在采收期套袋果实表面真菌数量均低于不套袋处理，但从果面分离鉴定出的优势真菌种类却多于未套袋处理，与前人研究结果一致，这可能是由于果实套袋后袋内温度、湿度、光照、透气性都发生了改变，套袋果实表面的微生态环境与未套袋果实差异很大[20-21]，使得套袋果实表面微生物群落结构和果实的生理都发生了改变，在采前摘袋后，果面微环境再次发生剧烈变化，这都会改变果面微生物的群落结构。

贮藏温度是影响贮藏产品表面微生物数量的重要因素，研究发现菠菜在4℃和10℃条件下贮藏1d 表面细菌数量由原来的11 个门减少到5 个门[22]。红枣成熟度和贮藏期果面微生物种群动态失衡是导致贮藏病害发生的主要原因[23]。 本研究结果表明，在贮藏期机械冷库和土窖贮藏处理均能减少果面微生物种类，果面优势真菌由采收期的22 种减少到17 种，属水平由10 个减少为8 个，与前人结果一致。 在贮藏前期土窖和冷库处理果面真菌数量均呈现先减少后增加的趋势，土窖处理果面真菌数量略低于冷库。 但在贮藏后期，土窖处理果面真菌数量继续增加，而冷库处理则相对稳定。 较土窖贮藏，冷库贮藏还能减少果面微生物的种类，由土窖贮藏的14 种优势真菌减少为10 种，属水平由8 个减少为5 个。 这可能是由于土窖和冷库贮藏温度不同导致的。 病原真菌的侵染致病通常具有潜伏性，有时并不会立刻引起果实发病，还与果树抗病能力和环境条件密切相关，比如扩展青霉菌、葡萄孢菌等，这类病菌需要借助伤口侵入到果实组织内部，进而危害果实[24]。 由此可知，冷库贮藏相对于传统土窖贮藏可以有效减少果面微生物的数量和种类，降低微生物侵染隐患。 由沈阳地区果园寒富苹果采收期和贮藏期表面优势真菌致病性检测可以看出， 在苹果采后贮藏期内果面优势真菌主要以青霉属、曲霉属和茎点霉属等为主。在采收期主要以青霉属为主，其次是曲霉属和茎点霉属等。在果实贮藏期土窖贮藏条件下的果面优势真菌与采收时一致，仍以青霉属为主，但在冷库贮藏条件下，曲霉属成为种类最多的优势真菌，其次是青霉属和茎点霉属等。 在采收和贮藏期间从果面分离鉴定出的29 种真菌中，大多数真菌都具有致病性，这些真菌在果实健康、果面完整的情况下并不侵染果实，引起腐烂，而当果面出现伤口时，这些真菌通过伤口侵入果实内部，果实组织中的营养和水分为真菌的定植和繁衍提供了丰富的养分供给，从而引起果实腐烂。 因此，尽量减少在采前产生的伤口和采收、分级、包装、贮藏、运输过程中造成的机械伤仍是减少贮藏期间苹果腐烂最传统、最有效的防治措施。

综上，果实套袋能有效减少苹果果面的真菌数量，但果面真菌种类有增加趋势。 冷库较传统土窖在贮藏后期能有效降低果实表面优势真菌的数量和种类。 果实采后贮藏期内致病微生物主要以青霉属和曲霉属真菌为主，由于该类微生物次生代谢产生的展青霉素会对人体健康和经济效益造成严重的影响，因此入库时应进行针对性的防治。 此外，本试验样品果均取自沈阳农业大学近年来在沈阳地区指导建设的生产示范园，管理水平相对较高，可以窥见一般果园采后的真菌病害发生风险更大。 因此，在沈阳地区寒富苹果大面积迅速发展的背景下，建议引导合作社或果农联合建设小型机械冷库，以降低采后损失，延长销售期限，增加果园效益。