Sprouty调控转化生长因子-β信号通路介导的上皮间充质转化抑制后囊膜混浊的研究进展△

张利民 包秀丽

后囊膜混浊(posterior capsular opacification，PCO) 是白内障手术的主要远期并发症，是由于手术切除纤维块后残留在囊袋中的晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)的异常生长引起的。在成人术后2～5 a的发生率为20%～40%，儿童几乎为100%。大量研究表明，LEC的上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及增殖过程是PCO发展的主要病理改变，转化生长因子β(transform growth factor-β，TGF-β)信号通路参与了LEC的EMT过程。TGF-β信号通路包括经典的Smad信号通路及非Smad信号通路。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路为主要的非Smad信号通路。Sprouty是RTK介导的Ras/ERK/MAPK 信号通路特异的抑制蛋白，并作为TGF-β诱导的EMT的负性调节因子抑制ERK信号通路，从而抑制EMT过程。对PCO的关键细胞过程和分子机制有更多的了解有助于降低PCO的发病率，研究Sprouty可能为将来预防EMT和白内障的发生提供有用治疗靶点。本文将对在PCO中，LEC的EMT过程以及Sprouty通过抑制TGF相关信号通路阻断PCO过程进行综述。

1 PCO

白内障是导致失明的主要原因，根据2010年评估得出白内障导致失明人数占盲人总人数的51%，约2000万人，占世界范围内视觉损伤人数的33%[1]。白内障手术与人工晶状体植入术能引起炎症反应应答导致组织损伤，并最终形成PCO。PCO导致视觉轴心上的光散射产生视力障碍以及各种视觉功能的异常，包括对比敏感度下降、眩光、色觉与立体视的改变。PCO的发生率及严重程度与手术的方式及人工晶状体光学边缘设计和材质相关，以及由术后残留的人LEC发生增殖、迁移及EMT[2-3]。钇铝石榴石(Nd:YAG)激光后囊切开术是目前治疗PCO的主要有效方法[4]，其目的是清除纤维化组织并使视轴清晰，但是也可能导致一些并发症，如人工晶状体损坏、眼压升高、黄斑囊样水肿或视网膜脱离[4-5]。

2 EMT

2.1 EMT的概念EMT及其逆过程间充质上皮转化(mesenchymal epithelial transition,MET)证明是癌症发展的不可分割的一部分[6]，在生长发育、纤维化过程、肿瘤转移和伤口愈合过程均有重要作用。EMT是上皮细胞失去它的分化表型转变成间质细胞表型的过程。EMT最初在胚胎发育过程中被确定是一个至关重要的分化和形态形成的过程，并且该病理过程是肿瘤早期扩散的重要机制[7]。EMT是一种独特的过程，上皮细胞经历显著的形态学改变，其特征是从上皮“鹅卵石样”表型向细长成纤维细胞表型(间充质表型)的转变，最终导致运动和侵袭性增加。在获得EMT特征时，细胞失去上皮细胞-细胞连接、肌动蛋白细胞骨架重组和促进细胞间连接的蛋白表达，如E-钙黏蛋白(E-cadherin)的下调和β-连环蛋白(β-catenin)重新定位，并在间充质标记物如波形蛋白、纤维连接蛋白的表达中获得。α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、纤维胶原Ⅰ型和Ⅲ型(fibrillar collagen Ⅰ/Ⅲ)、成纤维细胞特异性蛋白-1 (fibroblast specific protein-1，FSP-1)、N- cadherin以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活性增加，如MMP-2、MMP-3和MMP-9[8-9]。

2.2 EMT与LEC的关系大量的研究表明，LEC的EMT及增殖是PCO发展的主要病理改变。PCO是由赤道部及晶状体前囊残留的LEC发生伤口愈合反应导致了PCO的病理改变。LEC来源于表面外胚层，但它们也表达波形蛋白和上皮表面标记物(N-cadherin)，LEC增殖及经过EMT 导致成纤维细胞的形成及大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的表达，例如纤维胶原Ⅰ/Ⅳ、纤维连接蛋白以及α- SMA[10]。虽然在整个手术中整个晶状体的内容物被去除，但最后LEC经过细胞骨架的重排和上皮表型的丢失并迁移至后囊膜处最终导致PCO的形成[4]。有实验研究证实Wnt3a能够活化Wnt/β-catenin信号通路促进LEC发生EMT、迁移及增殖作用[11]，以及Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dickkopf-1抑制 Wnt3a介导的LEC的EMT及增殖过程[12]。

3 TGF-β信号通路

3.1 TGF-β家族TGF-β超家族超过了30种配体，包括TGF-β、活化素、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、结蛋白、生长分化因子(growth differentiation factor,GDF)及Müller抑制物(Müllerrian inhibitory substance,MIS)[13]。大量研究对TGF-β的分泌及活化进行了研究，TGF-β作为一种生物活性的二聚体复合物来进行合成和分泌。TGF-β受体家族包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受体，属单个跨膜α螺旋受体。在体内TGF-β的激活对调节多种生物机制极其重要[14]。TGF-β在皮肤瘢痕、肝和肺等纤维化性疾病的发病机制中是一个重要的配体，TGF-β能够上调参与组织纤维化过程的致纤维化细胞因子和分子，同时也能够调节炎症及免疫过程，纤维化病变过程的特点是肌成纤维细胞大量表达，并且TGF-β介导的ECM过量积累使组织收缩及功能受损[15]。晶状体中能够表达TGF-β1和TGF-β2，也表达TGF-β超家族的多种受体成员，然而TGF-β对LEC及晶状体纤维细胞的影响完全不同，TGF-β可能促进正常的晶状体纤维细胞分化，大量的体内及体外实验表明，TGF-β在LEC激活了异常的分化通路导致白内障的形成[14]。

3.2 TGF-β信号通路TGF-β 信号通路主要有经典的 Smad 信号通路及非 Smad 信号通路。Smad 信号通路是TGF信号转导的中心，TGF-β也能够通过激活相关受体活化非 Smad 信号通路，TGF-β-Smad 信号通路与非 Smad 信号通路间存在着“cross-talking”，可产生TGF-β的多种生物学反应，如细胞增殖、分化、生长停滞、凋亡和EMT等[16-17]。典型的TGF信号通路转导需要Smad2和Smad3的磷酸化，然后Smad2和Smad3转位到细胞核中，并启动靶基因的表达，如α-SMA、纤维连接蛋白、波形蛋白、纤维胶原Ⅰ/Ⅳ[18]。

非Smad信号通路如MAPK信号转导通路各个分支、 磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶信号通路(the phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway，PI3K-AKT)、Rho 样GTP酶信号通路[19-20]。MAPK信号转导通路包括细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和 p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)。这些非 Smad 信号通路能够作为独立的信号路径或与Smads相联系介导信号反应，也可以控制Smad信号通路的活动；TGF-β 激活 ERK MAP酶呈现低水平状态，尽管其激活水平通常远低于酪氨酸激酶受体，但是ERK的激活对于TGF-β 通路是非常重要的，ERK的激活和 Smad 信号通路参与了TGF-β介导的EMT过程，是肿瘤侵袭转移的关键点[21]；其次，ERK MAP激酶磷酸化受体激活了Smads信号来调节其核转移，并且ERK底物与Smads相互作用调节基因的表达[22]。

Lee等[22]研究表明，TGF-β直接磷酸化ShcA激活ERK MAPK信号通路，ShcA与酪氨酸结合并通过TbRI被磷酸化，从而为Grb2和So的募集提供对接位点，并且允许Shc/Grb2/Sos复合物在激酶级联上游启动Ras活化[21]。MAPK(尤其是ERK1/2)能够磷酸化Smad1/5的连接子，几乎总是阻断Smad1/5核易位[23]。TGF-β信号转导通路在EMT诱导中的作用增加Ras-ERK MAP激酶信号转导，由于ERK 1/2MAP激酶靶向多种转录因子，这种与TGF-β信号转导的合作可能发生在基因表达水平上，这与Smads在激活EMT过程中的关键作用是一致的。因此，MEK/ ERK MAP激酶信号转导的激活增强TGF-β诱导的转录反应，导致E-cadherin下调、N-cadherin上调和MMPs表达上调[21]。

3.3 TGF-β在LEC介导的EMT过程TGF-β/TβR/Smad信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路及PI3K/Akt信号通路被证实能够引起EMT的发生。TGF是EMT最有效的诱导剂。大量研究表明，TGF-β2使LEC从立方形到纺锤体样表型改变，并且增加了上皮标识的表达，如E-cadherin、闭合小带蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)以及间充质标记物α-SMA和fibronectin的表达、连接复合体被抑制，这些均导致了上皮细胞间黏附功能的失调[24-25]。Chen等[26]发现 TGF-β在LECs中激活的ERK1/2信号通路与经典的 TGF-β2/Smad信号通路是独立的过程，用U0126抑制ERK1/2信号通路显著阻止了TGF-β2介导的EMT，而且也抑制了经典的Smad信号通路和Jagged/Notch信号通路。

4 Sprouty

4.1 Sprouty的结构特点Sprouty(Spry)首先在果蝇中由成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)诱导的气管支化过程中作为负性调节蛋白被发现。果蝇Spry是第一个被发现的Spry蛋白家族成员，Spry的同源性在小鼠和人类中得到鉴定。Spry蛋白家族是由生长因子激活MAPK通路的活化介导负反馈环路调制器的高度保守成员，其表达被高度限制与已知的FGF信号位点的表达有关，小鼠和人的基因组均包括4种Spry基因(Spry1～4)[20-27]，它们具有高度保守的COOH末端和Spry结构域，以及可变的NH2-末端结构域[28]。spry3表达在成人的大脑和睾丸中表达，但在胚胎中并不表达。在小鼠中丢失的功能研究表明，Spry1和Spry2在多种器官发育的萌芽初期，包括肾脏、内耳、牙齿及脑皮质图形化的早期发育过程中发挥重要作用[29]。研究表明，Spry2是小鼠成熟晶状体纤维细胞表达的主要亚型，而且在晶状体发育期间，Spry2负性调控ERKs使晶状体囊泡分离，小鼠晶状体中基因敲除Spry2基因后增加了TGF-β诱导的EMT过程，spry2的过表达抑制了LECs的增殖及分化过程[18]。

4.2 Sprouty对Ras/MAPK 信号通路的抑制作用多种生长因子与后囊膜混浊有密切的联系，包括FGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、内皮生长因子 (endothelial growth factor，EGF)和 TGF，生长因子信号通路主要由受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)激活[18]。在哺乳动物中，Spry蛋白是RTK等信号通路的抑制因子，然而在一些细胞中Spry能够增强RTKs，如EGF受体(EGFR)信号通路[20]。大多数生长因子通过与细胞表面的RTKs有着高度亲和力来介导细胞应答，这导致了几个相关的细胞内信号通路的激活，包括PI3-K、PLC-γ和 Ras/ERK信号通路[30];Ras诱导的ERK通路(Raf-MEK-ERK)通常是生长因子通过RTKs激活并动员适应蛋白，如Shc和Grb2，以及Sos。激活的Ras与Raf家族蛋白关联通过三级酶促级联反应导致MEK和ERK的激活，TβRIs与RTKs相类似，活化TβRIs的募集并直接在酪氨酸激酶以及丝氨酸激酶上磷酸化ShcA，形成ShcA/Grb2/Sos复合物激活ERK/MAPK 信号通路，虽然TβRIs的酪氨酸激酶活性远低于RTKs，但是触发ShcA的磷酸化与Grb2和Sos相关，从而激活Ras/ERK通路[13,17,22]。

Spry是RTK介导的Ras/ERK/MAPK 信号通路特异的抑制蛋白，参与多种系统中抑制细胞的增殖、迁移和分化，然而对PI3K及其他的MAPK信号通路没有影响[31-32]。Spry抑制Ras/MAPK 信号通路的各级水平，有12个交互蛋白，包括微囊蛋白1(Caveolin-1)、c-Cbl、Grb2、FRS2、Raf-1 和Shp2 等，阻止与MEK结合从而抑制ERK通路[17,20]。其中 ERK信号分子是 MAPKs 家族的主要成员之一，ERK/MAPKs 在晶状体中是最丰富的 MAPKs，并且此通路的激活对胚胎的发育、细胞周期进程及细胞的分化有重要意义[30]。

最近研究表明，Spry蛋白在体外培养的肺癌细胞中能够逆转肿瘤细胞的 EMT表型，Spry的下调与TGF-β介导的EMT 和纤维化过程有重要的联系。特别是在EMT过程相关导致的恶性肿瘤转移期内，Spry1、 Spry2和Spry4在乳腺癌、前列腺癌、肝癌及肺癌中表达下调[33]。Zhao等[31]研究了选择性MAPK/ERK1/2拮抗剂Spry、Sef和Sprind对TGF-β诱导的EMT有阻断作用，结果提示所有被检测的拮抗剂均具有阻断TGF-β诱导EMT的能力，特别发现Spry1是最有效的拮抗剂，这可能归因于Spry1N-末端 EVH1(Enabled/VASP homology 1)的结构域。Spry蛋白对MAPK/ERK和RTK信号通路有反馈抑制作用。众所周知，ERK/MAPK途径可以响应TGF的刺激，并在许多细胞环境中协调TGF-Smad信号通路，因为ERK/MAPK信号通路是Spry蛋白的良好靶点，并且Spry的过度表达可以阻断异常TGF-Smad信号导致的EMT过程，这表明了ERK/MAPK通路在TGF诱导EMT中的作用。虽然TGF反应主要通过经典的Smad信号级联发生，但是通过与其他细胞内信号转导途径的相互作用，使其变得更加复杂及多样化[13]。

4.3 Sprouty对LEC的影响MAPK/ERK信号通路的抑制剂如 Spry、Sef、Spred在LEC中强烈表达。虽然晶状体中Sef的缺乏似乎对晶状体发育没有影响，但是当Spry1和Spry2基因从小鼠晶状体中敲除时，这些突变小鼠的晶状体上皮在出生后经过异常的细胞活动导致白内障的发生，而Spry2过表达则抑制LECs的增殖和分化，这些研究强调了Spry在小鼠晶状体发育和白内障发生中的重要性[34]。

晶状体中Spry的缺乏可损害LEC内的信号转导，包括使ERK1/2的磷酸化增加，以及Smad2/3、snail和slug(TGF-β下游靶基因)的核异位，从而导致E-cadherin分子的失调以及α-SAM上调，这均导致细胞向肌纤维母细胞转化、ECM的异常沉积，最终导致EMT的发生[31]。Spry对TGF-β有着逆转的联系，在晶状体上皮细胞和间充质细胞中Spry的表达下调了TGF-β的应答。而且，Shin等[20]最近研究证明，晶状体后囊中缺乏Spry1/2结果增加了ERK1/2的磷酸化，导致了Smad2信号通路的异常活化，使LEC发生上皮间充质转化，从而引起白内障的发生，以及在晶状体细胞中Spry过表达能够有效阻止TGF-β信号通路，转而抑制EMT过程和白内障的形成。Tan等[18]在人LECs中研究证实，Spry2通过抑制Smad2和ERK1/2的磷酸化过程负性调节TGF-β2诱导的 EMT和迁移，尽管Spry2对LECs中其他生长因子信号通路的调节作用还有待研究，但是Spry2对ERK1/2的抑制作用表明Spry2也可能负向调节人LEC中的FGF和EGF信号通路。

5 总结及展望

Spry作为抑制RTK信号通路激活的重要负向调节因子，与TGF-β信号通路存在交叉关系，Spry基因的敲除或Spry蛋白不表达不仅仅能够导致正常LEC生理功能的丧失，也可导致EMT，从而导致PCO病理过程的发生。总的来说，Spry在TGF信号通路中具有抑制作用。目前Spry在PCO的病理基础及发病机制仍有待更多的研究来确定。在人晶状体组织和上皮细胞中的Spry可能成为预防和治疗PCO的新的治疗靶点。