藏红花素对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用

常花蕾 朱娟 于敬妮 田蕴霖

视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)常见于青光眼急性发作的降眼压过程、视网膜血管栓塞性疾病的溶栓治疗过程等[1]，它是一个多因素综合作用的结果。既往研究发现，RIRI的机制与凋亡因素[2]、氧自由基损害、兴奋性氨基酸、钙超载及炎性细胞因子[3]等相关。鸢尾科植物藏红花由多种挥发性化合物和数种非挥发性化合物构成，其中具有药理学活性的代谢物可分为三大类：第一类为藏红花素，是藏红花的有色成分，且是主要成分；第二类为藏红花苦素，主要形成藏红花苦味；第三类为藏红花醛，为一种易挥发的油，主要形成藏红花的特征性气味和香味[4]。有研究表明，藏红花还具有抑制细胞凋亡的作用，本课题组前期研究发现，藏红花素可通过PI3K/AKT信号转导通路抑制RIRI视网膜神经节细胞凋亡[5]。本研究以藏红花为切入点，研究其有效成分藏红花素对RIRI时视网膜凋亡细胞数目及凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响，探讨在RIRI时藏红花素对视网膜的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及造模方法选取8～10周龄、体质量为200～250 g的健康无眼疾雄性SD大鼠24只，随机分为四组：对照组、模型组、藏红花素低剂量组和藏红花素高剂量组，每组6只。实验大鼠用100 g·L-1水合氯醛(4 mL·kg-1体质量)麻醉完毕后，将连接生理盐水瓶输液器的4.5号针头从颞侧角巩膜缘进针刺入眼前房，升高生理盐水瓶高度至1.5 m处，形成110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的眼压[6]。造成视网膜缺血60 min，然后拔出针头，恢复视网膜供血，即为RIRI模型。

1.2 主要试剂及仪器兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体、DAB显色剂(武汉博士德试剂公司)，TUNEL试剂盒(德国罗氏公司)，藏红花素冻干粉(美国Sigma公司)，移液器(德国EPPENDORF)，电子天平(瑞士METTERAE 100型)，切片机(德国Leica 2035)，恒温水浴箱(上海Spx-150B)，OLYMPUS显微镜(日本CHC)，多功能真彩色细胞图像分析系统(美国Media Cybernetics)，高速离心机(BECKMAN Avanti TM 30)，透射电子显微镜(日本日立H-600)。

1.3 藏红花素的给药方法每毫克藏红花素加生理盐水0.2 mL，稀释成5 g·L-1的藏红花素溶液。藏红花素低剂量组、高剂量组分别于造模前3 d、30 min定时腹腔注射藏红花素溶液5 mg·kg-1、50 mg·kg-1。

1.4 观察指标及测定方法

1.4.1 视网膜石蜡切片制备将SD大鼠深度麻醉后，沿角巩膜缘剪开球结膜，眼科显微剪伸入眼球后方剪断视神经，立即摘出眼球，放入新鲜配制的 40 g·L-1多聚甲醛固定液中4 ℃固定24 h，沿角膜缘将角膜剪开，再固定12 h，充分固定的目的是防止视网膜脱离。在组织变硬后去除角膜、虹膜、晶状体及玻璃体等，待眼球壁全层完整分离后进行石蜡包埋。平行于视神经矢状轴，在视神经周围2 mm内连续切片6张，每张切片厚度约为5 μm。

1.4.2 视网膜透射电子显微镜标本制备再灌注24 h后用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速摘取眼球后在冰环境中环角巩膜缘切开，弃去眼前节和晶状体，保留眼杯。将眼杯在显微镜下剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，置于体积分数2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定2 h以上；0.1 mol·L-1磷酸缓冲液浸洗30 min，10 g·L-1四氧化锇固定液4 ℃固定2 h，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液浸洗10 min，乙醇梯度脱水：体积分数30%乙醇10 min、体积分数50%乙醇10 min、体积分数70%乙醇10 min，体积分数70%乙醇醋酸双氧铀块染2 h或过夜，体积分数90%乙醇10 min×2次，体积分数100%乙醇10 min×3次，环氧丙烷置换10 min，环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后将组织块做半超薄切片1～2 μm，美蓝染色后光学显微镜下定位，超薄切片机进行切片，厚50～70 nm；醋酸铀、柠檬酸铅染色后透射电子显微镜下观察、拍照。

1.4.3 视网膜中Caspase-3免疫组织化学染色一抗稀释浓度为11000，加二抗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，PBS冲洗后DAB显色，苏木素复染，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。判断标准：阳性反应为细胞浆内棕黄色颗粒。染色结果采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，测定Caspase-3表达的平均光密度(A)值。

1.4.4 视网膜TUNEL染色分析凋亡细胞表达石蜡包埋的切片常规脱蜡，用蛋白酶K室温孵育30 min，PBS冲洗2次。PBS洗片后，与阻断剂(体积分数0.3% H2O2甲醇溶液)室温孵育30 min，PBS洗片。PBS冲洗2次后擦干样品周围的水，滴加50 μL TUNEL反应混合液。在湿盒中37 ℃孵育60 min，PBS冲洗3次。冲洗结束后擦干样品周围的水分，加入50 μL过氧化物酶，在湿盒中37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次。再加入50 μL DAB底物溶液，室温孵育30 min，PBS冲洗3次；最后封片，在光镜下分析结果。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。凋亡细胞以Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行分析(每张切片随机取4个视野，每个视野面积0.2 mm × 0.2 mm，以视神经为基准分别向两侧各取2个视野)，计算视野中呈棕黄色阳性染色的细胞均数，定量分析视网膜组织中凋亡细胞的表达情况。

2 结果

2.1 藏红花素对RIRI时视网膜凋亡细胞数目的影响对照组(图1A)未做任何处理，在神经节细胞层、内外核层几乎未发现凋亡细胞的阳性染色，凋亡细胞数为(1.10±0.23)个。模型组(图1B)在视网膜神经节细胞层和内核层中发现大量棕黄色着色的细胞，凋亡细胞数为(27.40±0.96)个，模型组内外核层细胞排列紊乱，结构疏松且增厚。藏红花素低剂量组(图1C)可见神经节细胞层、内核层凋亡细胞数较模型组减少，为(8.40±0.41)个，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，内外核层排列较模型组密集。藏红花素高剂量组(图1D)凋亡细胞数较模型组和藏红花素低剂量组明显减少，为(4.30±0.47)个，和藏红花素低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组及藏红花低剂量组比较，内外核层细胞排列较整齐。

图1 大鼠视网膜TUNEL染色观察结果(×400)。A：对照组；B：模型组；C：藏红花素低剂量组；D：藏红花素高剂量组。箭头示凋亡细胞

2.2 藏红花素对RIRI时视网膜Caspase-3表达的影响RIRI 24 h后大鼠视网膜免疫组织化学染色结果显示，Caspase-3染色阳性者为棕黄色或浅棕色，位于细胞浆内。对照组大鼠视网膜Caspase-3染色为阴性(图2A)，模型组于视网膜神经节细胞层可见棕黄色颗粒位于细胞浆内(图2B)，藏红花素低剂量组Caspase-3蛋白表达量与模型组类似(图2C)，藏红花素高剂量组Caspase-3表达与对照组类似(图2D)。模型组Caspase-3A值为70.37±13.89，较对照组(35.03±6.22)显著增加(P<0.05)；藏红花素高剂量组Caspase-3A值为32.59±11.81，较模型组低，接近对照组；藏红花素低剂量组Caspase-3的表达量接近模型组，A值为75.98±21.45。

2.3 透射电子显微镜下观察结果对照组大鼠视网膜内核层细胞大小均匀，形态规则，核仁清晰，核膜光滑，核质均匀分散(图3A)。模型组大鼠视网膜内核层出现凋亡细胞，表现为细胞核质浓缩，染色质边集，核膜肿胀、溶解，核偏位及核浓缩；细胞浆出现空泡化改变(图3B)。藏红花素低剂量组大鼠视网膜内核层凋亡细胞数目较模型组减少，多数细胞形态正常，核膜、核仁清楚，少数细胞出现凋亡改变(图3C)。藏红花素高剂量组大鼠视网膜内核层细胞与对照组类似，凋亡细胞数目较模型组及藏红花素低剂量组明显减少(图3D)。

图2 大鼠视网膜Caspase-3蛋白表达染色观察(×100)。A：对照组；B：模型组；C：藏红花素低剂量组；D：藏红花素高剂量组。箭头示棕黄色染色

图3 RIRI后24 h大鼠视网膜内核层超微结构(×4000)。A：对照组；B：模型组；C：藏红花素低剂量组；D：藏红花素高剂量组。箭头示凋亡细胞

3 讨论

RIRI发生在眼科许多疾病中，即使视网膜恢复血流，视网膜的损伤却仍在继续发生，患者的视力仍然受到危害。对于此类疾病，恢复血流已经不是根本，再灌注后的保护治疗已显得尤其重要，也是近几年研究的热点。因此，积极探索其发病机制和有效的药物治疗具有重要的临床意义。针对RIRI发病机制的研究初步表明，除坏死以外，凋亡也是其发生过程中神经元细胞死亡的主要类型，通过在电镜定位下的兔RIRI模型中超微形态学改变表明，视网膜神经节细胞层和内核层中存在凋亡细胞[7]。牛膺筠等[8]研究也证明，细胞凋亡在RIRI中起着非常重要的作用。

藏红花是鸢尾科番红花属球根类草本植物，其干燥柱头作为传统中药和藏药，具有活血化瘀、消肿止痛以及治疗胃病、肺病、肝病等功效。对其深入研究发现，藏红花还具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化及抑制细胞凋亡的作用。Qi等[5]证明，藏红花素可以通过PI3K/AKT信号通路阻止视网膜缺血性损伤导致的RGCs凋亡。Chen等[9]研究发现，藏红花素可以保护由氧化应激诱导的大鼠视网膜缺血性损伤。吕伯昌等[10]研究发现，藏红花素可通过阻碍细胞外Ca2+内流，使线粒体依赖凋亡信号通路失活，从而阻止RGCs凋亡，证明藏红花素有神经保护作用，可以防止RGCs凋亡。Soeda等[11]研究发现，藏红花素能够抑制神经元细胞发生凋亡。本实验利用TUNEL技术检测发现，对照组视网膜组织中几乎未发现凋亡细胞的阳性表达，凋亡细胞数为(1.10±0.23)个；模型组在视网膜神经节细胞层和内核层中发现大量棕黄色着色的细胞，其凋亡细胞数为(27.40±0.96)个；藏红花素低剂量组可见神经节细胞层、内核层凋亡细胞数较模型组减少，凋亡细胞数为(8.40±0.41)个，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；藏红花素高剂量组凋亡细胞数较模型组和藏红花素低剂量组明显减少，凋亡细胞数为(4.30±0.47)个，和藏红花素低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组神经节细胞层及内核层存在大量的凋亡细胞，呈棕黄色浓染，该组大鼠视网膜超微结构观察可见神经节细胞层及内核层出现大量凋亡细胞，细胞核质浓缩，染色质边集。说明RIRI时存在视网膜细胞凋亡，凋亡是其发病机制之一，而藏红花素能通过降低凋亡细胞数有效保护视网膜免受RIRI。

国外有研究报道，活性氧簇可以触发线粒体释放蛋白激酶C，它是激活Caspase-3的重要事件，同时是启动凋亡的关键步骤[12]。Caspases的激活被认为是进入凋亡途径的特异性标志，Caspase-3是凋亡事件的最终执行者。此外，内源性和外源性细胞凋亡激活的途径交叉于Caspase-3环节[13]。Caspase-3免疫组织化学染色结果提示，在急性高眼压所引起的RIRI过程中，有细胞凋亡机制参与其中，使用藏红花素50 mg·kg-1腹腔注射后能够显著降低视网膜Caspase-3表达量，抑制神经细胞凋亡。大鼠视网膜内核层超微结构显示，藏红花素高剂量组大鼠视网膜内核层细胞与对照组类似，凋亡细胞数目较模型组减少，多数细胞形态正常，核膜、核仁清楚，同样支持上述观点，说明高剂量藏红花素改善视网膜病理损伤作用效果更好。藏红花素可阻断Caspase-3诱导的细胞凋亡，减轻视网膜的超微结构改变，从而达到对视网膜损伤的预防保护作用。

综上所述，藏红花素在大鼠RIRI中发挥重要作用，它不仅可以降低视网膜凋亡细胞数，还可以降低凋亡相关蛋白Caspase-3的表达，且高剂量的藏红花素效果更为显著。然而，RIRI本身是个多因素协同的结果，目前的研究水平还远未阐明其具体机制。藏红花素是通过哪一种具体的机制来降低细胞的凋亡，还有待进一步研究。