酶的最适温度的时间依赖性和温度依赖性

杨洪斌（重庆市第七中学校 重庆 400030）

在探讨温度对酶的影响时，教师经常是根据教材中的“钟型曲线”进行讲授，即在酶的最适温度前，酶的活性随温度的升高而升高；在酶的最适温度后，酶的活性随温度的升高而降低。因此，在生产或实验时要选择酶的“最适温度”作为反应的“最佳温度”。这种观点几乎根深蒂固地存在于所有教学和各种教辅资料中。其实，所谓酶的“最适温度”并没有“最适”的说法。

1 温度对酶稳定性的影响原理

在影响酶活性的所有因素中，温度对其的影响最具挑战性。温度几乎影响生化反应的各个方面，包括酶和底物的pH 依赖性、电离、金属结合相互作用、酶构象变化、蛋白质的寡聚化、氢键、疏水相互作用及过渡态等。这些复杂的行为都与各种键相互作用及其与温度相关的焓和熵变化有关。温度对酶的影响主要表现在2 个方面：一是在一定温度范围内保持酶自身的热稳定性或维持自身结构的稳定性；二是温度会通过影响酶的活性位点的亲和力影响酶的活性。一般情况下可通过以下方面增强酶对温度的耐受性：1）选择适宜的溶液pH 值；2）加入稳定配体（例如底物、辅因子、金属离子及调节效应因子）；3）保护酶免受蛋白质水解；4）其他蛋白质（被称为保护性胶体效应的蛋白质）的存在。由图1［1］可知，在1～40℃内，温度每升高10℃，反应速率就会增加一倍；但在高温下，产物的形成速率迅速下降，且在达到平衡前酶的活性就消失了。

图1 不同温度下酶的产物的形成过程［1］

2 酶的稳定性与催化原理

酶的“微观稳定性”与局部结构可逆变化相关的能量有关。微观稳定性是造成酶活性位点的柔韧性或刚性的原因，这影响催化的底物或配体结合的位置［2］。酶的总体稳定性是宏观稳定性与微观稳定性之间的自由能差异［3］。由于较弱的分子相互作用，酶的活性位点比整体酶更灵活，且酶的活性位点会比整体蛋白质更快地失去其功能（加入化学变性剂或加热后）变性［4］。“诱导契合”模型假定酶活化是由于酶的活性位点与底物之间相互作用，进而引起酶活性位点的构象改变形成的。“波动契合”模型表明，酶的天然构象在溶液中存在多种状态，这些酶的不同构象适用于不同温度下酶能维持一定的功能。

3 平衡模型解释温度对酶活性的影响

酶活性对温度的依赖性一般用“经典模型”进行描述，包含2 个过程：催化反应（用kcat描述）和不可逆失活（由kinact定义）。这些温度依赖性的速率常数分别通过催化活化能和热失活反应的活化能进行表征。最近，很多科学家都发现短时间内酶具有表观最佳温度。Thomas 和Scopes［5］的研 究表明，某些酶在高温下的活性低于变性时所能解释的活性。于是科学家提出了一个平衡模型。

其中酶活性形式（Eact）与非活性形式（Einact）处于平衡状态，Einact是不活跃的形式。不可逆的热失活到变性状态（X）。平衡由平衡常数（Keq）描述。基于此，可进行如下转换：

平衡用平衡时的焓（△Heq）和新的热力学系数Teq进行表征；Teq表示活性酶（Eact）和无活性酶（Einact）浓度相等时的温度，因此，它相当于热力学平衡常数Km。通过绘图，得到了图2A［2］，成为了经典模型；当在A 图的基础上引入催化的活化能和不可逆反应的活化能后，就得到了图2B［2］这样的平衡模型。这个类似于“帐篷”的模型已经过了超过30 种酶的验证［6］，是一种可靠的速率-温度-时间三维平衡模型。当没有发生变性时，所有表现出“帐篷”类型的酶的活性温度在时间为零时表现最佳，而且研究表明Teq与稳定性无关。

图2 速率-时间-温度平衡模型［2］

4 酶的最适温度并不是“最适”的原理

4.1 酶活性的时间依赖性和温度依赖性 平衡模型提出后，有很多研究者对该模型进行了验证。Peterson 等［3］用芳基酰基酰胺酶做了一个酶的速率-时间-温度曲线，由图3A 可知，酶的最佳活性是一个不断变化的量，它会随着时间和温度的变化而变化。在温度为58.5℃时，由于Eact／Einact平衡而导致酶的活性非常快速损失达到了60%。在相同温度下，变性导致酶的活性损失只在几分钟内就完成了［6］。由图3B［5］可知，在相同温度下，酶的反应速率会随着反应时间的变化而变化，也可以看出反应时间越短，其活性越高，催化的速率就越快；同样，在相同的时间内，不同温度下，酶的活性也不一样［7］。无论是“帐篷”曲线还是用具体酶做实验，都能体现出酶的活性并没有一个固定的最佳活性，它会随时间和温度的变化而变化，表现出对时间和温度的依赖性。

图3 酶的活性对时间和温度的依赖［3，5］

4.2 酶的最适温度与不可逆变性 由于酶的活性具有对时间和温度的依赖性，因此，酶并没有最适温度。图4A 是一个常见的图［8］，也是高中生物学教材和练习题中常见的温度对酶的催化速率影响的示意图。在平时的教学中，教师会解释在最适温度之前，随着温度升高，酶的催化活性升高，因此，酶反应速率会加快；超过最适温度，酶的活性降低，酶反应速率下降；过高的温度会导致酶不可逆变性，这个“高温”是全部酶都失活的温度。由图4A［8］可知，这种说法是不正确的。在“最适温度”之前，酶的变性是一种可逆的变性；但是一旦超过了最适温度，酶就开始变性，而且这种变性是一种不可逆的变性，所以“最适温度”实际上是酶开始发生不可逆变性的温度。因此，在实际的生产和应用中，并不会选择这样一个“最适温度”作为酶的反应温度。同时由图4B［8］可知，温度诱导的催化活化和温度诱导的失活，取决于这2 个过程相应的过渡态的能量。将温度升高到可逆范围内会导致酶有更高的活性，降低温度会使酶的活性恢复到其原始活性。当发生不可逆变性时，冷却至较低温度则不会恢复催化活性，构象的灵活性是许多酶在热变性和不可逆的催化活性损失方面的弱点。

图4 酶在不同温度下的失活过程［8］

5 研究进展

温度对酶的影响非常复杂。温度过高时，酶会发生不可逆变性；变性是一个复杂的化学过程，既要考虑到蛋白质的大小和三维结构，又要考虑温度会影响酶在构象变化之前或之后的化学反应。目前，科学家还在研究不同温度环境下生物体内酶活性的变化，主要将酶分为冷适应的酶和嗜热酶。研究表明，冷适应酶具有更灵活的活性位点［9］，其通过弱化酶活性位点中的分子内力而产生；而嗜热酶的活性位点则更加刚硬［10］。冷适应酶和嗜热酶的灵活性变化是由于活性位点的氨基酸结构变化导致的。冷适应的微生物可以产生冷适应的酶，它们能在比嗜温生物更低的温度下调节自身结构进行催化反应。冷适应酶在其最适温度范围内的热稳定性范围是有限的，因为在低温下构象变化会随温度增加而增加，会导致酶活性位点的功能在蛋白质的3D 结构变性之前丧失，在其最适温度下具有更刚性的活性位点［11］。嗜热酶的活性位点的灵活性在其最适温度下灵活性最大。总之，酶的灵活性和生物生活的环境密切相关，这可能是生物在进化过程中对栖息环境的一种适应。已有的研究表明，酶的活性具有时间和温度的依赖性，因此，酶并没有“最适温度”。酶的活性是一个随温度和时间变化而变化的量，同时，平时所谓的“最适温度”其实是酶发生不可逆变性的温度。