桂北地区青钱柳不同时期活性成分分析

郭 亮，李晓铁，秦丽凤

(1.桂林市林业科学研究所，广西 桂林 541004；2.桂林林业学校，广西 桂林 541004)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)又名青钱李，摇钱树等，为胡桃科青钱柳属植物，该属仅包含青钱柳一个品种，是国家Ⅱ级重点保护濒危植物，同时也是冰川四世纪保存下来的珍稀树种，产地主要分布于我国湖南、安徽、江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖北、四川、贵州、广西、广东和云南南部[1]。桂北地区属亚热带湿润季风气候，气候温和，雨量充沛，因此较为适合青钱柳生长。

青钱柳不仅是优良的造林树种和绿化树种，其活性成分还具有丰富的药用价值。近年来随着对青钱柳研究的深入，发现叶片中其含有可溶性多糖、黄酮、皂甙等活性成分。在可溶性多糖研究方面，2001年李磊等利用超声波萃取手段，从青钱柳叶片中提取了1种多糖复合物，并通过试验证明该种多糖复合物具有降血糖的功效[2]；2006年邓小云等利用小鼠慢性皮下肿芽试验，证明多糖物质具有消炎和抗凝血作用[3]。在黄酮类化合物研究方面，2007年蔡文伟等发现黄酮类化合物具有抗癌和抗肿瘤的功效[4]；2003年曹纬国等究研证明黄酮类化合物在治疗心脑血管疾病、抗病毒和增强机体免疫系统功效方面具有积极作用[5]。皂甙类化合物具有多种重要的生物活性和广泛的药理作用，例如抗过敏、消炎、抗病毒、治疗白血病等[6]。

青钱柳叶片中活性成分含量随采摘树龄和采摘时间具有一定的变化规律，本次探究旨在利用对比试验和方差分析法，探究不同采摘树龄和采摘时间下，各组分含量的差异，寻找较为适合的采摘树龄和采摘时间，提高青钱柳叶片的利用率，同时选出优良的无性系家系，为后期探究应用生产打下基础。

1 实验材料及方法的选取

1.1 供试样品及采集地概况

采集地点为桂北地区，采集样品为桂林市花坪保护区本地无性系家系，桂北地区属亚热带湿润季风气候，气候温和，雨量充沛，平均海拔150 m左右，全年无霜期300 d左右，平均气温19 ℃，年平均降雨量 1 900 mm，是我国的青钱柳主产区之一(见表1)。

1.2 实验仪器及材料

1.2.1 实验材料

葡萄糖(对照品，Sigma公司)，苯酚(AR，国药集团)，浓硫酸(AR，厂家)，青钱柳叶片(广西桂林)，石油醚(60～90，AR，国药集团)，无水乙醇(AR，广东光华)，芦丁标准品(标准品，国药集团)，香草醛，冰醋酸，甲醇，正丁醇，人参皂苷(标准品，国药集团)。

表1 样品采摘时间、地点及采摘树龄

Tab.1 Sample picking time, place and tree age

样品编号Sample number采摘时间Picking time采摘地点Picking place采摘树龄/aPicking age/a12017年8月9日桂林市林业科学研究所222017年8月9日桂林市林业科学研究所332017年8月9日桂林市灵川县大圩镇442017年8月9日桂林市灵川县灵田镇1052017年11月13日桂林市林业科学研究所262017年11月13日桂林市林业科学研究所372017年11月13日桂林市灵川县大圩镇482017年11月13日桂林市灵川县灵田镇1092018年4月12日桂林市林业科学研究所2102018年4月12日桂林市林业科学研究所3112018年4月12日桂林市灵川县大圩镇4122018年4月12日桂林市灵川县灵田镇10

1.2.2 实验仪器

分光光度计(UV-1800，岛津)，索氏提取器，移液枪(20～200 μL、100～1000 μL、500～5000 μL，德国赫施曼)。

1.3 实验方法

1.3.1 青钱柳叶片中可溶性多糖的提取及测定方法

青钱柳叶片经过除杂、干燥、粉碎后，用多功能提取器在60 ℃下石油醚脱脂脱色3 h ，滤去石油醚，室温晾干后作为提取原料。

用葡萄糖配成50 μg·mL-1的标准溶液。准确移取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL 标准溶液于各试管中，制作标准曲线。

预处理后的青钱柳叶片经水提、过滤后定容到相应体积，取1 mL 滤液加入3 mL 无水乙醇，溶液在 8 000 r·min-1转速下离心10 min，弃去上层清液得到沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，准确吸取该溶液50 μL，试管加入500 μL 5%苯酚溶液，混匀后快速加入4.0 mL浓硫酸，振荡混匀80℃水浴20 min进行显色，在490 nm 下测定其吸光值，根据所得回归曲线方程计算多糖含量，按以下公式计算多糖得率:青钱柳叶多糖得率= 滤液中多糖的质量/ 青钱柳叶质量×100 %。

1.3.2 青钱柳叶片中总黄酮的提取及含量测定方法

用芦丁对照品准确配制0.147 mg·mL-1标准溶液，移取0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL于6只10 mL具塞试管中，加入1 mL 1%的三氯化铝/甲醇溶液，用甲醇定容，摇匀，放置15 min，制作芦丁标准曲线。

精密称取5 g，精确到0.0001 g，加入30 mL甲醇回流4 h，过滤，提取3次，合并，定容至100 mL，取50 μL，具塞试管中，加入1 mL 1%的三氯化铝/甲醇溶液，用甲醇定容，摇匀，放置15 min，于410 nm 波长下测定吸光度，根据标准曲线计算青钱柳总黄酮的含量。

1.3.3 青钱柳叶片中总皂苷的提取及含量测定方法

精密称取人参皂苷16.6 mg，定容至10mL，吸取人参皂苷Re标准溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL，分别置于具塞试管中，于水浴中挥尽溶剂，冷却，再加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和硫酸磺1.0 mL，绘制标准曲线。

精密称取青钱柳叶片10g，置于250 mL烧瓶中，加乙醚40 mL，水浴回流2h，挥去乙醚的脱脂样品，再用70%的乙醇溶液30 mL回流至流液无色，乙醚提取液置蒸发皿中，在水浴上浓缩至干，残渣加水10mL使溶解。用50 mL水饱和的正丁醇萃取，重复萃取4次，合并正丁醇萃取液，用20 mL正丁醇饱合水洗涤。正丁醇溶液转移到蒸发皿中，在水浴上浓缩至干，用甲醇溶解残渣并将其转移至10mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得供试液。

吸取20 μL供试液置于具塞试管中，按“标准曲线绘制”项下的操作测定吸光度，在标准曲线上查出相应的总皂甙含量。

1.4 数据的处理

每种样品取3株，混合均匀后进行有效成分提取，检测的结果利用SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 实验结果

将采集的样品送至广西壮族自治区林业科学研究院利用紫外分光光度法进行检测，检测结果如表2所示。

表2 各成分含量检测结果

Tab.2 Test results of each component content

12组样品中可溶性多糖含量最高的为样品3(可溶性多糖含量为14.69 mg·g-1)，最低的为样品12(可溶性多糖含量为10.99 mg·g-1)；样品5组合检测到的总黄酮含量最高，为40.33 mg·g-1；样品12总黄酮含量最低，为25.01 mg·g-1；样品5的总皂苷含量最高，为23.15 mg·g-1，最低为样品12，含量为15.02 mg·g-1。

2.2 结果分析

利用spss软件进行方差分析，检验采摘时间和采摘树龄对各成分含量影响的显著程度，结果如表3：可溶性多糖中采摘时间的F=2.557，P=0.157>0.05，差异不显著，说明不同采摘时间对青钱柳叶片中可溶性多糖含量的影响并不显著，采摘树龄的F=15.935，P=0.003<0.01，差异极显著，说明不同采摘树龄对青钱柳叶片中可溶性多糖含量的影响极其显著；总黄酮中采摘时间的F=68 771.677，P=0.000<0.01，说明采摘时间对总黄酮含量具有极显著的影响；采摘树龄的F=165.780，P=0.000<0.01，说明采摘树龄对总黄酮含量同样具有极显著的影响；总皂苷中采摘时间的F=18.613，P=0.003<0.01，采摘树龄的F=48.464，P=0.000<0.01，说明采摘时间和采摘树龄对青钱柳叶片中总皂苷的含量都有极显著的影响。在方差分析中表现为影响显著和影响极显著的成分都需要进行进一步的多重比较分析(见表3)。

表3 采摘树龄和采摘时间对各成分含量影响的方差分析

Tab.3 Variance analysis of the effect of picking age and time on the content of components

表4为采摘时间的多重比较结果，从中可见，总黄酮在α=0.05显著水平下，3个采摘时间都在不同列，说明3个采摘时间之间存在显著差异，最高为2017年11月13日；总皂苷在α=0.05显著水平下3个采摘时间分布在不同列，证明这3个采摘时间两两之间同样具有显著差异，且2017年11月13日采摘的总皂苷含量最高。

表4 不同采摘时间的多重比较(SNK法，α=0.05)

Tab.4 Multiple comparison between different picking time(SNK, α=0.05)

表5为不同采摘树龄间的多重比较结果，从中可见，可溶性多糖在α=0.05显著水平下，树龄3年、4年、10年不在同一列，3个水平间存在显著差异；两年分别与3年和10年在同一列，说明之间没有显著差异；两年和4年不在同一列，存在显著差异，最高为4年；总黄酮中4个采摘树龄同样不在同列，说明四个采摘树龄之间同样存在显著差异，最高为两年；总皂苷中4个采摘树龄同样分布在不同列，证明这4个采摘树龄两两之间同样具有显著差异，且树龄为两年时采摘的总皂苷含量最高。

表5 不同采摘树龄的多重比较(SNK法，α=0.05)

Tab.5 Multiple comparison between different picking age(SNK, α=0.05)

3 结论与讨论

本次探究利用方差分析和各个水平间的多重比较，发现青钱柳叶片采摘时间和采摘时的树龄，对可溶性多糖含量，总黄酮含量，总皂苷含量会有一定影响。其中采摘树龄对可溶性多糖含量影响分析中F=15.935，P=0.003<0.01，表现的差异极显著，而采摘时间对可溶性多糖含量影响分析中F=2.557，P=0.157>0.05，差异不显著，因此树龄达到4年时，可溶性多糖含量较多，如果想提取更多可溶性多糖，建议选择4年生青钱柳叶片进行采集；采摘时间和采摘树龄分别对总黄酮含量影响分析中P=0.000<0.01，表现为影响极其显著，采摘时间和采摘树龄分别对总皂苷含量影响分析中P值分别为0.003和0.000，均小于0.01，同样表现为影响极其显著，因此当采摘时间在11月中旬，采摘树龄为两年时，青钱柳叶片中的总黄酮含量和总皂苷含量较高，如果想获得更多的皂苷和黄酮，应选择两年生的青钱柳并在每年的11月中旬进行采集。此外探究所选取的桂林市花坪保护区本地无性系家系在可溶性多糖含量、黄酮含量、皂苷含量方面都具有较高的水平，具有很高的培养价值。

提高青钱柳叶片中活性成分的利用率，一方面是要选择各组分含量较高的时期进行采摘，另一方面是需要更为合理高效的提取方法，本次探究主要侧重于总结各组分的采摘时间，而在提取方法方面，主要采用的是前人较为常见的方法，提取率仍有提高的空间，在今后的探究工作中，将着手探索更为高效便捷的青钱柳活性成分提取方法。