药食两用3号方对大鼠热证痛风性关节炎的抗炎抗氧化活性研究

张伯瑞 薛崇祥 何世勇 肖楠 田源 郁万刚 陶方

【摘 要】目的：研究药食两用3号方对热证痛风性关节炎的作用。方法：将32只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组和复方干预组，每组8只。除空白对照组外，其余各组均通过注射尿酸钠造成大鼠痛风性关节炎模型，并置于高温环境下制成热证模型，用秋水仙碱和痛风药食两用3号方分别对秋水仙碱组和复方干预组大鼠灌胃给药。检测踝关节周长增加百分比，末次给药后腹主动脉采血，检测大鼠血清中αN乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、超氧化物歧化酶、尿酸、肿瘤坏死因子-α的水平。结果：与模型对照组比较，复方干预组踝关节周长增加百分比、αN乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、尿酸、肿瘤坏死因子-α均明显降低，超氧化物歧化酶明显升高（P < 0.01）。结论：药食两用3号方对热证痛风性关节炎大鼠有降尿酸、抗炎抗氧化的作用。其作用机制可能与降低超氧化物歧化酶活性，抑制肿瘤坏死因子-α、αN乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶合成与释放有关。

【关键词】 痛风性关节炎;热证型;药食两用3号方;抗炎;抗氧化;大鼠

据痛风流行病学数据显示，近年来痛风发病率呈逐年上升趋势，已成为严重威胁人类健康的代谢类疾病[1]。痛风的中医病机为先天禀赋不足，后天嗜食膏粱厚味加之外邪袭入皮肉筋脉[2]。现代研究发现，痛风是以嘌呤代谢紊乱为主要病因，由尿酸盐晶体沉积引发的非感染性疾病。其临床特点为高尿酸血症以及尿酸盐沉积所致的反复发作的关节炎和软组织损伤。目前，西药改善急性痛风性关节炎症状效果显著，但是伴随着较大的不良反应[3]。中医药治疗痛风具有不良反应少等优点，而药食两用方更兼备方便、可长期服用等特点，成为研究的热点[4]。药食两用3号方是根据中华人民共和国卫生部颁布的《既是食品又是药品的物品名单》拟定，所选药物兼具药用和食用两种特性，主要用于治疗热证型痛风。本实验建立热证痛风性关节炎大鼠模型，以αN乙酰氨基葡萄糖苷酶（αNAG）、β-半乳糖苷酶（β-gal）、超氧化物歧化酶（SOD）、尿酸（UA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等为指标，观察药食两用方对热证痛风性关节炎的缓解程度，为痛风药食两用方的研制提供客观理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠（清洁级）32只，体质量（200±20）g。由大连医科大学动物实验中心提供，动物合格证号SCXK（辽）2013-0003。大鼠饲养于动物实验中心SPF级饲养环境，按昼夜节律自然照明，室温为20～22 ℃，空气湿度保持在50%～60%，自由摄食饮水。

1.2 药物与试剂 痛风药食两用3号方由金银花、当归、甘草、葛根、马齿苋、薏苡仁、枳椇子、茯苓组成，经大连医科大学中西医结合学院中药方剂学教研室张琳副教授鉴定。水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，生产批号Q/12HB4218-2009）;吐温80（北京索莱宝科技有限公司，生产批号301C052）;尿酸钠（上海晶都生物技术有限公司，生产批号BCBS7438）;秋水仙碱（北京盛世康普化工技术研究所，生产批号Q-006-150731）;αNAG、β-gal、UA、SOD、TNF-α检测试剂盒（南京森贝伽生物技术有限公司，生产批号分别为180327R0945、180327R0941、180327R0944、180327R0008、180327R0040）。

1.3 仪 器 电子天平（奥豪斯仪器有限公司，型号PX423ZH）;冷凝回流装置、圆底烧瓶、电热套（上海科恒实业发展有限公司，型号DZTW）;Heidolph旋转蒸发仪（德祥科技有限公司，型号Value）;超速离心机、-80 ℃冰箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号分别为Sorvall WX系列、Forma 88000];酶标仪（美谷分子仪器有限公司，型号SpectraMax iD5）。

2 方 法

2.1 痛风药食两用3号方的制备 将金银花20 g、当归20 g、甘草10 g、葛根10 g、馬齿苋10 g、薏苡仁10 g、枳椇子10 g、茯苓10 g置于圆底烧瓶中，加7倍量双蒸水，加热回流提取2次，每次2 h，合并提取液，于旋转蒸发仪将提取液浓缩至45 mL。

2.2 动物分组 将32只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组和复方干预组，每组8只。

2.3 造模方法 将模型对照组、秋水仙碱组、复方干预组大鼠置于（37±2）℃的高温环境，每日1次，每次1 h，持续半个月，造成热证大鼠模型[5]。第7天，空白对照组注射生理盐水，其余各组大鼠用质量分数为10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔麻醉后，于右足踝关节内注射尿酸钠溶液（25 g·L-1）0.2 mL，以关节囊对侧鼓起为准，复制大鼠痛风性关节炎模型[6]。

2.4 给药方法 造模后24 h，秋水仙碱组大鼠予秋水仙碱1.5 mg·kg-1·d-1灌胃，每日1次;复方干预组大鼠予痛风药食两用3号方22 g·kg-1·d-1灌胃，每日2次;空白对照组、模型对照组大鼠予生理盐水10 mL·kg-1·d-1灌胃，每日2次。连续给药7 d。

2.5 指标检测方法 于造模后0，24，48，72，96，120，144，168 h等8个时间点，用无弹性棉线和四用不锈钢带表卡尺测量各组大鼠右后足踝关节的周长值，计算并记录踝关节周长增加百分比，计算公式：周长增加百分比=（测定时间点关节周径-初始周径）/初始周径×100%。末次给药后，各组大鼠腹主动脉取血清，采用酶联免疫法对血清中αNAG、β-gal、SOD、UA、TNF-α含量进行检测。按试剂盒说明书进行操作，在酶标包被板上加标准品，待测样品孔中先添加稀释液，再加待测样品，封板后置37 ℃温浴30 min。稀释，洗涤后每孔加酶标试剂辣根过氧化物酶在37 ℃下温浴30 min，加入底物后37 ℃避光保存15 min，加入终止液使反应终止，测量450 nm波长处各孔吸光度。以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠踝关节周长增加百分比比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠各时间点踝关节周长增加百分比均显著增加（P < 0.01），于24 h左右达到高峰;与模型对照组比较，复方干预组大鼠各个时间点踝关节周长增加百分比均降低（P < 0.01）;与秋水仙碱组比较，复方干预组大鼠在120 h、144 h，踝周长增加百分比明显降低（P < 0.01）。见表1。

3.2 各组大鼠血清中αNAG、β-gal、SOD、UA和TNF-α含量比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清中αNAG、β-gal、UA、TNF-α含量显著增加，SOD含量显著降低（P < 0.01）;与模型对照组比较，秋水仙碱组和复方干预组大鼠血清中αNAG、β-gal、UA、TNF-α含量显著降低，SOD含量显著增加（P < 0.01），且复方干预组变化更显著（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

4 讨 论

个体差异以及所感外邪种类的不同，决定了所患痛风的性质不同。痛风主要包括风湿蕴热证、痰瘀痹阻证和久痹正虚证[7]。风湿蕴热证为痛风发作早期最常见的证型[8]，在这里笔者不是应用一般的痛风性关节炎大鼠模型，而是主动建立热证痛风性关节炎动物模型，更符合人类痛风的发病规律，能更有针对性地研究此药方对热证型痛风即痛风早期阶段的作用。痛风发作是在血液中尿酸含量超过其物理溶解度，以单钠尿酸盐晶体的形式析出基础上发生的，尿酸盐晶体与局部微环境相互作用主要通过巨噬细胞，产生以白细胞介素-1（IL-1）为主，还包括IL-8、IL-6、TNF-α等细胞因子，这些细胞因子又可以引起中性粒细胞和单核细胞的浸润，产生更加广泛的炎症反应[9]。氧自由基主要来源于尿酸盐晶体引起的免疫炎症反应的过程，氧自由基可以在巨噬细胞内激活细胞因子的表达[10]，大量产生的氧自由基需要SOD等抗氧化酶进行对抗，这就造成了SOD的减少[11]，所以本实验选取SOD作为一个表现炎症反应程度的敏感指标。αNAG和β-gal同属细胞溶酶体内的水解酶，可间接反映痛风的程度，其主要来源于肾小管上皮细胞，当肾小管受到损伤时会释放到血液中，引起其浓度升高[12]。血液中高浓度的尿酸会沉积于肾脏形成尿酸盐结晶，这些结晶造成周围单核细胞浸润，导致肾小管上皮细胞坏死。所以利用αNAG和β-gal可反映痛风的严重程度。TNF-α可以促进炎症反应的发生，在痛风局部炎症中起重要作用[13]。笔者在前期设计实验时参考了多篇文献，均通过测定大鼠关节肿胀度以及αNAG、β-GAL、SOD、UA、TNF-α等5种指标来衡量痛风造模是否成功和药物对痛风性关节炎的效果[14-16];因此，选用大鼠关节肿胀度及以上指标作为最终的检测指标，病理学研究内容将在后期相关分子生物学实验时一起展示。

痛风药食两用3号方是针对热证痛风性关节炎的病因病机，以清热利湿、健脾除痹为治则而制定。方中金银花、当归为君药，葛根、马齿苋、枳椇子为臣药，薏苡仁、茯苓、甘草为佐药。全方以清热除湿、调和阴阳功效为主，另兼补脾益胃，以期达到缓解炎症、止痛清热的效果。现代药理学研究显示，金银花中的有机酸类化合物绿原酸具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用[17];当归的有效成分阿魏酸具有清除氧自由基的作用[18];甘草可以选择性地抑制与花生四烯酸发生级联反应的代谢酶活性，使前列腺素、白三烯等炎性介质无法产生，抑制前列腺素的合成与释放，从而发挥抗炎作用[19];葛根可有效清除机体内源性抗脂质过氧化物及氧自由基物质[20];枳椇子有抗氧化作用[21]。

本实验采用ELISA检测方法，模型對照组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），说明造模是成功的。与模型对照组比较，秋水仙碱组、复方干预组大鼠关节肿胀度下降（P < 0.01），αNAG、β-gal、UA、TNF-α含量均显著降低，SOD含量显著增加（P < 0.01），但复方干预组变化更显著。说明痛风药食两用3号方对热证痛风性关节炎的作用主要为减轻踝关节的红肿热痛症状，起效快，作用强，同时具有降UA作用，标本兼顾。该方治疗热证痛风性关节炎的疗效优于秋水仙碱，而且避免了秋水仙碱引起的皮肤黏膜损害，泌尿系统、消化系统功能影响等不良反应[22];同时，药食两用方调配方便、针对性强，既保持了中医汤剂辨证论治、疗效显著的特色，又克服了传统汤剂煎煮繁琐、携带不便等缺点，与现代生活节奏加快的发展趋势相适应，可长期服用，缓缓调治，与痛风性关节炎的反复发作、无法治愈的特点相吻合，为其治疗提供了新的方法和思路。

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收稿日期：2018-09-02;修回日期：2019-03-11