混合菌株和外源赖氨酸对鱼酱发酵品质的影响

郑志颖，周 晶，袁 丽，高瑞昌*

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

鮰鱼原产于北美洲，我国于1984年引入，目前已推广至全国多个省市，成为重要的特色淡水鱼类之一[1]。鮰鱼肉质较鲜美、营养价值很丰富，养殖产量逐渐增加[2]。近年来，受美国鮰鱼法案的影响，给养殖和加工业者带来了很大的经济损失。鮰鱼在加工中又存在脂肪含量高、土腥味大等技术难题[2]，因此开发适合国内消费市场需求的鮰鱼产品，对打开国内鮰鱼市场、推动鮰鱼产业健康发展具有重要的现实意义。目前，发酵水产品是市场上深受消费者喜爱的鱼加工制品，市场前景较为广阔。对下脚料进行开发、深加工，不仅是对资源的综合利用，而且能够保护环境，减少废水、废物排放，实现绿色发展。

中度嗜盐菌是在NaCl浓度为0.5～2.5 mol/L之间生长最佳的一类微生物[3]。目前已在多种腌制或盐渍类发酵海产品中鉴定出大量的中度嗜盐菌，这些嗜盐微生物不但能够改善和提高食品风味，还能够加快食品的生产效率，并且抑制某些腐败细菌的生长。如Tetragenococcus菌株被用于食品如酱油等的发酵中，加快了酱油的发酵[4]。根据中度嗜盐菌耐盐及产蛋白酶的性质，可广泛应用于发酵水产品中。如Udomsil等[5]利用1 株产蛋白酶中度嗜盐菌Tetragenococcus halophilus MS33和从泰国鱼露种筛出的产挥发性物质的Virgibacillus sp. SK37两株菌来提高鱼露的发酵品质。

赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一，第一限制性氨基酸，机体不能自身合成，必须从食物中补充。赖氨酸作为甜味氨基酸，可在一定程度上提高发酵鱼酱的风味。芮鸿飞[6]研究了外源氨基酸对黄酒发酵的影响，得出不同氨基酸对黄酒挥发性香气有不同程度的影响。鲜有报道研究外源氨基酸对水产品发酵的影响。因此本研究以鮰鱼副产物为原料，探究食盐质量分数为15%条件下混合发酵剂（Halobacillus campisalis、Halobacillus faecis、Bacillus aquimaris、Bacillus hwajinpoensis）和外源赖氨酸对发酵鱼酱品质的影响，开发出具有特色风味和功能性的发酵鱼酱，增加淡水鱼的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鮰鱼碎鱼肉购于镇江市京口区欧尚超市。从河北沿海地区传统发酵虾酱中筛选出的中度嗜盐菌（H.campisalis、H. faecis、B. aquimaris、B. hwajinpoensis）实验室保存。

甲醛、氢氧化钠、酚酞、乙醇、邻苯二甲酸、硼酸、碳酸钾、阿拉伯胶、甘油、甲基红指示剂、亚甲基蓝指示剂、赖氨酸、磺基水杨酸 国药集团（上海）化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AG 22331离心机 德国艾本德股份公司；SW-CJ-1FD型单人单面超净台 上海苏净实业有限公司；HZQ-2全温振荡器 江苏金怡仪器科技有限公司；LRH-250培养箱 上海一恒科技有限公司；HP6890/5973气相色谱-质谱联用仪 美国Supelco公司；日立L-8900全自动氨基酸分析仪 日本高新技术公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学技术有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；ZB-20型斩拌机 诸斌市嘉凯食品机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 碎鱼肉前处理

鮰鱼碎鱼肉利用斩拌机斩断，置于－20 ℃冻藏备用。

1.3.2 混合菌种发酵剂的制备

发酵菌种采用4 株中度嗜盐菌混合菌种，将其分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作3 次。将培养的菌种菌液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，然后用无菌生理盐水洗涤2 次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4 ℃保存，并于24 h内使用。

1.3.3 发酵鱼酱的制备

经处理好的鮰鱼副产物，分成4 种处理。第1组只添加15%食盐，记为a组；第2组添加0.1%赖氨酸和15%食盐，记为b组；第3组添加混合发酵剂和15%食盐，记为c组；第4组添加混合发酵剂、0.1%赖氨酸和15%食盐，记为d组。利用搅拌机分别将4 组中的鮰鱼碎鱼肉与所加物质（食盐和赖氨酸）充分混合后，置于玻璃发酵瓶中，于4 ℃冰箱放置24 h用于发酵。发酵鱼酱前，在c和d组中加入菌液，其添加量为105CFU/g，比例为1∶1∶1∶1。对照组加入同体积的生理盐水。将处理好的玻璃发酵瓶置于37 ℃培养箱发酵60 d，即得发酵鱼酱。在发酵过程中，每隔5 d对鱼酱进行搅拌。每个处理3 个重复。

1.3.4 发酵鱼酱品质的测定

1.3.4.1 pH值的测定

称取5 g鱼酱，加25 mL蒸馏水，高速均质1 min后，10 000 r/min离心15 min，测上清液的pH值，重复测定3 次。

1.3.4.2 总酸和氨基酸态氮的测定

参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》酸度计法[7]。

1.3.4.3 挥发性盐基氮的测定

参照GB 5009.44—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》微量扩散法[8]。

1.3.4.4 游离氨基酸的测定

取5 g鱼酱，加入20 mL 4%磺基水杨酸，高速均质，在4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清液重复离心，再稀释5 倍。过0.22 μm水系滤膜，取上清液上机测定。

1.3.4.5 挥发性风味物质的测定

挥发性风味成分的萃取：采用顶空固相微萃取的方法提取鱼酱中的风味物质。取鱼酱5 g，萃取温度为60 ℃，萃取时间为30 min，将萃取头插入气相色谱进样口于250 ℃解吸5 min。

气相色谱-质谱测定：初温40 ℃，保持4 min，然后以5 ℃/min升温至120 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升温至240 ℃，保持10 min。进样口温度250 ℃，以氦气为载体，不分流进样，流速0.8 mL/min，进样量20 μL。

质谱条件：电子电离源，温度为200 ℃，四极杆温度150 ℃，检测器电压350 V，发射电流200 μA，电离电压70 eV，扫描范围为30～500 u。

1.3.4.6 感官评定

采用定量描述性分析法。由10 人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分范围0～9 分，分别对鱼酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行评分，分数越高，代表味道越浓烈。

1.4 数据统计分析

采用Origin 8.0绘图，SPSS 19.0进行数据统计分析。每组数据均为3 次重复的平均值。利用one-way ANOVA检验分析不同处理之间的差异显著性，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 鱼酱pH值和总酸含量变化

如图1所示，4 种处理鱼肉酱中的总酸含量分别为0.382 5%、0.63%、0.607 5%和0.585%，pH值分别为6.44、6.02、6.03和6.06。在发酵60 d时，总酸质量分数变化和pH值变化趋势相一致，总酸质量分数越多，pH值相对越低。与未添加氨基酸和混合发酵剂的鱼酱a相比，其他3 组鱼酱的总酸质量分数显著升高，pH值显著降低（P＜0.05），说明添加氨基酸和混合发酵剂都能一定程度增加总酸质量分数。总酸和pH值不同主要是由于发酵过程中氨基酸、有机酸和胺类化合物的产生不同[9]。总酸的增加可能由于氨基酸的加入和发酵过程中产生的有机酸造成的。

2.2 鱼酱的氨基酸态氮含量变化

图2 发酵60 d不同处理鱼酱的氨基态氮含量Fig. 2 Amino nitrogen contents in fish pastes

氨基酸态氮是发酵产品的重要指标之一，其能够在一定程度上反映发酵产品的老化程度和风味特点[10-11]。如图2所示，4 种处理鱼肉酱中的氨基酸态氮质量分数分别为0.511%、0.549 5%、0.514 5%和0.549%。与鱼酱a相比，添加混合发酵剂后，氨基酸态氮含量变化较小（P＞0.05），可能由于混合发酵剂自身直接利用游离氨基酸态氮、小分子肽等作为营养物质，或者发生了一系列氨基酸等物质参与的复杂反应[12]。与未加赖氨酸的两组鱼酱（a、c）相比，添加赖氨酸酸的两种鱼酱（b、d）中的氨基酸态氮含量显著上升（P＜0.05），其原因推测可能是外加赖氨酸的影响。4 种鱼酱中的氨基酸态氮的含量均较高，均在一定程度上赋予鱼酱良好风味的形成及较高的营养价值。

2.3 鱼酱的挥发性盐基氮含量变化

图3 发酵60 d不同处理鱼酱的挥发性盐基氮含量Fig. 3 TVB-N contents in fish pastes

挥发性盐基氮是指某些蛋白质及含氮物质被微生物分泌的蛋白酶降解或脱氨反应形成，其可以反映产品的腐败程度[13-14]。从图3可以看出，4 种处理的挥发性盐基态氮的含量分别为37.8、30.1、23.45、24.2 mg/100 g。欧盟规定鱼肉中的挥发性盐基氮含量不得高于35 mg/100 g[15]。可见，未添加氨基酸和混合发酵剂的鱼酱a已经开始腐败，可能是某些细菌会利用游离氨基酸等含氮物质产

生了挥发性盐基氮物质[16]。与鱼酱a相比，鱼酱b挥发性盐基氮显著下降（P＜0.05），推测原因可能是氨基酸的存在，发酵过程中产生了有机酸等物质，这与总酸的结果相一致。c和d两种鱼酱的挥发性盐基氮显著降低（P＜0.05），推测可能是混合发酵剂的加入，抑制了这类细菌腐败微生物的生长从而降低了挥发性盐基态氮的生成。也可能是总酸的含量增加，发生了酸碱中和。

2.4 鱼酱的游离氨基酸变化

表1 发酵60 d不同处理鱼酱的游离氨基酸种类及含量Table 1 Free amino acid composition in fish pastes

氨基酸对发酵水产品的风味有重要贡献，是发酵水产品香味的重要前体物质。发酵产品的风味与呈味活性物质的相互作用和平衡有关[17-18]。由表1可知，与鱼酱a相比，其他3 种鱼酱中，游离氨基酸总量、鲜味氨基酸含量、甜味氨基酸含量和苦味氨基酸含量均增加。与鱼酱a比，添加混合发酵剂后的鱼酱c中，天冬氨酸含量增加了9.7 倍，谷氨酸的含量也显著增加。该结果也与氨基酸态氮的结果一致。由此可见经混合发酵剂发酵后，混合发酵剂产生的外源蛋白酶促进了鱼肉蛋白质的水解，游离氨基酸含量显著增加，改善了发酵鱼酱风味。b和d两种鱼酱中，由于添加了0.1%赖氨酸，即鱼酱中外源赖氨酸的含量为100 mg/100 g，这也解释了b和d两组鱼酱中赖氨酸较多的原因。除去最初赖氨酸的量，4 种鱼酱赖氨酸的含量并无显著区别。与鱼酱a相比，各种氨基酸均在一定程度上得到增加，尤其是谷氨酸的增加，表明氨基酸的加入能够促进鱼酱发酵，使其产生更多的游离氨基酸，其具体机理需要进一步研究。与鱼酱b相比，鱼酱c中的游离氨基酸的总量略有减少。赖氨酸本身的加入会增加鱼酱中赖氨酸的测定含量，也可能是混合菌株利用某些氨基酸作为营养物质，以便更好地发酵，产生其他的风味物质。

综上所述，鱼酱添加赖氨酸和混合发酵剂经发酵后，游离氨基酸含量及种类丰富，鲜味和甜味氨基酸的组成及其含量能反映鱼酱的滋味鲜美程度，能够增强食品的持续性、满口性、特征风味和甜味等[19]。日常摄入这种发酵鱼酱，还可弥补赖氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸的不足。

2.5 鱼酱的挥发性风味物质变化

图4 发酵60 d鱼酱挥发性风味成分的总离子流图Fig. 4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in fish pastes

表2 发酵60 d不同处理的鱼酱的挥发性风味组成成分Table 2 Volatile flavor components identified in fish pastes

采用顶空固相微萃取法萃取鱼酱中的挥发性成分，并经气相色谱-质谱检测分析，发酵60 d鮰鱼酱挥发性成分变化的总离子色谱流图及分析结果见图4，共检测出37 种挥发性物质成分。各挥发性成分及其相对含量分析结果见表2。

2.5.1 酸类

酸类对鱼酱中的酸味起着重要作用，发酵60 d 4 种鱼酱中酸类相对含量分别为42.23%、63.65%、75.7%、50.7%。结果表明添加氨基酸和混合发酵剂明显提高了酸类的相对含量，原因可能是微生物发酵过程中对氨基酸的降解和不饱和脂肪酸的氧化。其中，发酵鮰鱼酸味主要来源于异戊酸、乙酸、异丁酸的增加，支链酸包括异戊酸和异丁酸，异戊酸的相对含量最多，推测认为其产生与氨基酸和微生物作用有关。直链脂肪酸包括乙酸、己酸和丙酸。乙酸的相对含量分别为6.92%、13.43%、9.12%、10.44%，乙酸具有酸味，乙酸主要由微生物发酵糖类或其他物质氧化产生。推测乙酸的增加与微生物发酵有关。己酸具有果香，己酸的增加加强了鱼酱的果香。短链的脂肪酸对风味有很大的影响，具有较低的阈值，往往表现为强烈的奶酪味道[20]。酸类是发酵制品风味的主要特征风味，已有研究表明酸类来源于脂肪酸的氧化或微生物分解碳水化合物、对氨基酸的的发酵作用，尤其是那些耐盐的微生物[21]。这也解释了添加混合发酵剂后，酸类物质大幅上升的原因。孟凌玉[20]在虾头酶解发酵液中检测到异戊酸的含量逐渐增加，推测其产生与微生物作用有关。张洵[22]在鲢鱼发酵研究中发现乙酸含量丰富，对发酵鲢鱼风味有相对较大的贡献。综上所述，添加氨基酸和混合发酵剂均在一定程度上增加了酸类物质的产生，促进了鮰鱼酱的发酵。

2.5.2 醇类

鱼酱中醇类的种类相对较为丰富，醇类通常具有蘑菇香、芳香、植物香、酸败和土气味[20]，对鱼酱的发酵有着重要作用，但醇类化合物的阈值较高，对整体风味贡献较小。添加赖氨酸和混合发酵剂后，异戊醇相对含量分别从12.88%下降至1.25%、2.60%、1.5%。异戊醇的产生是一个典型的艾利希途径，具有腐臭和辛辣的气味[23-24]。异戊醇的大幅度降低避免了鮰鱼酱腐臭味的产生。其原因可能是添加赖氨酸和混合发酵剂后，抑制了鱼自身的一些腐败微生物的生长，减少了异戊醇的产生，减少了酸败味的产生。不饱和醇1-戊烯-3-醇相对含量从0.63%分别增加至1.13%、2.60%、1.50%；苯乙醇是酱油中的芳香影响化合物，在鱼酱中主要提供麦芽香气[25]。可见，除异戊醇变化明显，其他醇类变化不大，又因为直链饱和醇的香味阈值较高，所以对鱼酱发酵风味的影响较小。不饱和醇阈值较低，具有蘑菇香气和类似的金属味[26]，但含量较小，故对鱼酱发酵风味影响较小。

2.5.3 酮类

酮类一般由美拉德反应生成，也可能是由于脂质降解、氧化或其进一步反应生成[27]。适量的酮类贡献甜的花香和果香风味，但过量的酮类则会产生不良气味。酮类的阈值相对较高，对鱼肉的气味贡献相对较小[23]。酮类可增强腥味物质。添加赖氨酸和混合发酵剂后，甲基酮包括2-丁酮、2-庚酮变化微小，2-庚酮的阈值较低，提供了蓝莓味，2-丁酮的阈值较高，风味贡献还需进一步的研究。酮类大多数是甲基酮。除甲基酮，检测的酮类还有丙酮、2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮。丙酮的相对含量低于其阈值，对风味的影响较小。只在鱼酱b中检测到了2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮，2,3-丁二酮有苯醌气味，稀溶液有奶油香气，其阈值较低，对鱼酱发酵作用较大。3-羟基-2-丁酮有黄油的气味，但阈值较高，故对鱼酱发酵影响极小。可见，添加氨基酸对鱼酱中的某些酮类的产生有一定影响，而菌的加入对酮类物质的产生影响较小，原因可能是发酵过程中，由于微生物的作用，其转变成了其他的风味物质，使得醛类物质降低。

2.5.4 醛类

挥发性醛类物质可以产生理想的风味，同样也会给产品带来酸败风味。直链和支链醛一般会提供青草和辛辣味，而不饱和醛则产生蔬菜和鱼腥味。醛类的相对含量并没有发生明显变化，直链的脂肪醛包括壬醛和己醛，只在鱼酱a中检测到，相对含量分别为0.66%、0.71%，直链醛能够产生香草、青草和辛辣的味道，但其相对含量较低，故对发酵鱼酱风味影响极小。支链醛包括异戊醛，相对含量分别为0.55%、0.46%、0.43%，在鱼酱d中没有检测出异戊醛。可见，添加氨基酸和混合发酵剂对醛类几乎无影响，可能是由于氨基酸和混合发酵剂的存在，更多地转化成了其他的风味物质。

2.5.5 酯类

酯类化合物是一种良好的风味物质，低含量的酯类物质能够产生明显的香气。添加氨基酸和混合发酵剂后，酯类的相对含量从0.63%分别增加至3.82%、1.36%、2.59%。主要为异丁酸乙酯、亚砷酸三酯等。异丁酸乙酯具有水果香气，能够赋予鱼酱一定的风味。结果表明添加氨基酸和混合发酵剂有助于酯类物质的产生。有研究发现酯类在许多发酵的水产制品中检出[28]。挥发性酯类主要是由各种醇和羧酸的酯化作用形成的。酯类能够赋予发酵水产品果香甜香。

2.5.6 其他风味化合物

含氮化合物是最具风味的主要成分之一。鱼酱a和b中检测到了2,5-二甲基吡嗪，含量分别为1.88%、1.56%；吡嗪化合物的风味阈值较低，是许多热加工食品中的重要性挥发性成分，赋予了食品浓郁的坚果香和烤肉香[29]。烃类化合物阈值较高，故对鱼肉发酵风味影响不大[30]。鱼酱d中检测出了2-正戊基呋喃，相对含量为0.66%，具有豆香、果香、泥土、青香及类似蔬菜的香韵[31]。除此之外，其他化合物如酚类，2,6-二叔丁基对甲酚虽然含量较低，但对鱼酱的风味形成也有一定的贡献。

2.6 感官评定及定量描述性分析

图5 发酵60 d不同处理鱼酱的风味定量描述性分析图Fig. 5 Quantitative descriptive analysis (QDA) of flavor characteristics of fish pastes

通过对4 种处理鱼酱进行感官评分，由图5可知，4 种鱼酱中，与未添加混合发酵剂和外源赖氨酸的鱼酱a相比，其他3 组鱼酱鲜味均较高，腥味较低，发酵味较高。风味较好，添加混合发酵剂和赖氨酸能够改善鱼酱的发酵风味，赋予鱼酱良好风味。

3 结 论

鱼酱作为一种发酵调味品，其具有广泛的消费市场，通过发酵改善了鱼酱的营养价值和风味。通过测定pH值、总酸、氨基酸态氮、挥发性盐基氮，得到添加混合发酵剂和外源赖氨酸能够提高总酸和氨基酸态氮，降低挥发性盐基氮含量，在一定程度上抑制某些腐败菌的生长，提高了鱼酱的营养价值。通过结合感官评定、气相色谱-质谱对鱼酱进行风味评价，可以有效检测混合发酵剂和赖氨酸对发酵60 d鱼酱的风味成分的变化，酸类和醇类变化比较明显，这些风味物质的不同从一定程度上造成了感官评价不同。通过添加混合发酵剂和外源赖氨酸，可以得到风味较好的发酵调味品。