复方硫酸新霉素温敏凝胶的研制及其疗效观察

孙淑彦，顾永卫，杨 盟，刘继勇,唐 震*

(1.海军军医大学长海医院口腔科，上海 200433;2.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；3.上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海 200011)

口腔溃疡是口腔科常见的一类疾病，看似不严重，却给病人生活带来了极大的不便，严重影响到病人正常的说话、饮食。复方硫酸新霉素口腔溃疡涂膜是海军军医大学长征医院的自制药品，用于治疗各类口腔溃疡，其临床应用已有20多年，疗效确切。但复方硫酸新霉素口腔溃疡涂膜在临床应用过程中存在给药不便，易被迅速清除，药效无法长时间维持等问题，限制了其在长效给药方面的应用，因而现已停止生产使用。作者保留原涂膜主要有效成分，改变其剂型，研制了复方硫酸新霉素温敏凝胶，并应用于大鼠创伤性口腔溃疡模型对其疗效进行验证，为临床应用提供了实验依据。

1 材 料

1.1 仪器 游标卡尺(上海美耐特实业有限公司)；DM2500光学显微镜(德国莱卡公司)；Gemini2流变仪(Bohlin Gemini 公司)；LC-10ADVP高效液相色谱仪(日本岛津制作所)；FA-2004电子天平(上海精科天平仪器厂)。

1.2 药品和试剂 硫酸新霉素(批号201511040，宜昌三峡制药有限公司)；盐酸达克罗宁(批号16110501，江苏海慈生物药业有限公司)；乙酸地塞米松(批号170104，天津天药药业股份有限公司)；乙酸地塞米松对照品(批号100122-200304，中国药品生物制品检定研究院)；维生素E(批号1708103，浙江医药股份有限公司新昌制药厂)；乙醇(批号1F210020，湖南九典制药有限公司)；冰片(批号170920，云南林缘香料有限公司)；泊洛沙姆407(P407，批号HO6S8C43094)、泊洛沙姆188(P188，批号H1107C22457)由上海源叶生物科技有限公司提供；羟苯乙酯(批号170801)、冰乙酸(批号140907)由湖南尔康制药股份有限公司提供；甲醇(批号18095055，美国天地有限公司)；口腔溃疡膜(批号171129，海军军医大学长征医院自制)。

1.3 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20) g，由海军军医大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(沪)2017-0002。大鼠购入后饲养一周，使其适应新的环境。

2 方法和结果

2.1 复方硫酸新霉素温敏凝胶的制备

2.1.1 制备工艺 采用冷溶法制备复方硫酸新霉素温敏凝胶[1,2]。将处方量的P407和P188于蒸馏水中溶胀过夜，得空白凝胶基质。将处方量的硫酸新霉素、达克罗宁、乙酸地塞米松加入到溶胀好的空白凝胶基质中并搅拌均匀。最后，将处方量的冰片、羟苯乙酯和维生素E溶于少量乙醇中，将制备好的药物水凝胶加入到乙醇溶液中，搅拌均匀，即得载药口腔黏膜温敏凝胶。

2.1.2 处方筛选 采用Gemini2流变仪对复方硫酸新霉素温敏凝胶样品进行流变学测定。流变学参数：样品从25 ℃升温至55 ℃，升温速度5 ℃/min，样品温度精确控制在±0.1 ℃内，应变幅度为1.0%，振荡频率为0.5 Hz，4/20 mm平板，间隙0.5 mm。

2.1.3 P407和P188的用量对流变学参数的影响 用不同比例的P407(18%～20%)和P188(2%～6%)制备空白凝胶，并考察不同条件下P407和P188的用量对流变学参数[相变温度与37 ℃对应的黏度]的影响，结果见表1。由表1可见，单独使用P407时，相变温度呈现出浓度依赖性，即浓度较高的P407溶液在较低温度下即可以发生胶凝。固定P407比例不变，少量P188即可以对P407的相变温度产生较大的影响。随着P188加入量的增加，相变温度会逐渐上升。

表1 采用不同比例泊洛沙姆407和泊洛沙姆188制备的凝胶的相变温度及37 ℃时的黏度值Table 1 Phase transition temperature and viscosity values at 37 ℃ of the gel prepared with different ratios of poloxamer 407 and poloxamer 188

综合考虑相变温度、黏度和口腔温度等因素，以比例为18∶2的P407与P188为空白凝胶处方，并按2.1.1项下方法制备载药口腔黏膜温敏凝胶，测得的流变学曲线见图1，可见复方硫酸新霉素温敏凝胶在33 ℃发生相变，因此将P407和P188比例确定为18∶2，作为空白温敏凝胶的最优处方。

图1 泊洛沙姆188和泊洛沙姆407比例为18∶2时制备的凝胶的流变学曲线Figure 1 Rheological curve of the gels prepared with poloxamer 188/poloxamer 407 at a ratio of 18∶2

2.1.4 最优处方验证 按照最优处方同法制备3批样品，测得的平均相变温度为(33.1±0.32) ℃。表明优化的复方硫酸新霉素温敏凝胶处方工艺稳定，且温敏凝胶的相变温度高于室温且低于口腔温度，给药方便；在口腔温度条件下黏度适宜，给药后在患处停留时间较长。

2.2 复方硫酸新霉素温敏凝胶对大鼠口腔溃疡的疗效

2.2.1 大鼠口腔溃疡模型的建立 按照参考文献[3-4]的方法制备大鼠口腔溃疡模型。采用20%乌拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。准备一长3 cm，内径0.4 cm的双端开口玻璃管，玻璃管一端内置一小棉球，平于玻璃管开口。将此端垂直平贴于大鼠下唇内侧黏膜上，从另一端缓缓滴入50%冰乙酸，烧灼黏膜90 s，棉签蘸去多余冰乙酸。24 h后大鼠口唇潮湿，实验区出现明显溃疡，表面黄白色，部分有溃烂，有渗出，表明造模成功。

2.2.2 给药方法 48只大鼠按随机数字表完全随机分组法分成模型组，空白凝胶组，对照组，复方硫酸新霉素温敏凝胶高、中、低频率给药组，每组8只。除对照组外，

其余5组按 2.2.1项下方法造模。 造模24 h后测量每组大鼠口腔溃疡面积并给药，给药前用棉签蘸0.9%生理盐水轻轻擦拭大鼠口腔表面。给药方法如下：(1)高频率给药组予复方硫酸新霉素温敏凝胶每日6次，2 h喷一次，每次摇匀后喷3下；(2)中频率给药组予复方硫酸新霉素温敏凝胶每日4次，3 h喷一次，每次摇匀后喷3下；(3)低频率给药组予复方硫酸新霉素温敏凝胶每日2次，4 h喷一次，每次摇匀后喷3下；(4)空白凝胶组予不加任何辅料的空白凝胶，P407和P188含量同复方硫酸新霉素温敏凝胶，给药剂量和频率同高频率给药组；(5)模型组予0.9%生理盐水擦拭溃疡;(6)对照组予口腔溃疡膜，按使用说明书将药膜撕成适宜大小，粘贴于患处10～15 min，让药膜自行溶化，每日给药2次。除模型组和对照组，其他4组都使用特定的喷雾设备，摇匀后将药液喷于溃疡处，每次喷3下，维持30 s，待凝胶在溃疡处干燥并形成凝胶膜，给药后禁食禁水30 min。

2.2.3 溃疡面大体观察 拍照记录大鼠造模成功的溃疡面情况(见图2A)以及用药d 4的组织愈合情况(见图2B～F)。造模成功后，各组大鼠溃疡面由黄白色假膜覆盖，渗出明显，炎症反应重，创面凹陷；给药4 d后，模型组和空白凝胶组仍有渗出，溃疡面明显，损伤仍严重，炎症反应重；复方硫酸新霉素温敏凝胶各频率给药组和对照组溃疡面光滑，创面愈合良好，炎症反应轻，其中高频率给药组创面基本痊愈。

图2 用药第4天各组大鼠的溃疡面情况Figure 2 Ulcer surface of the rats in different groups on the fourth day after medicationA:模型组;B:空白凝胶组;C:对照组;D:复方硫酸新霉素温敏凝胶高频率给药组;E:复方硫酸新霉素温敏凝胶中频率给药组;F:复方硫酸新霉素温敏凝胶低频率给药组

表2 各组大鼠口腔溃疡面积的比较
Table 2 Comparisons of the oral ulcer sizes of the rats in different groups

组别给药前给药第1天给药第2天给药第3天给药第4天空白凝胶组 25.46±0.3425.16±0.86 20.49±1.12 16.72±0.93 13.73±0.68 模型组 25.59±0.4024.99±0.7621.52±0.9817.72±0.9414.07±0.69对照组 25.55±0.4521.79±0.57**△△12.27±0.78**△△9.45±0.49**△△7.67±0.47**△△低频率给药组25.87±0.5522.39±0.40**△△15.57±0.65**△△▲▲10.96±0.4**△△▲▲9.20±0.35**△△▲▲中频率给药组25.38±0.7121.47±0.37**△△□□11.86±0.54**△△□□7.57±0.92**△△▲▲□□3.81±0.77**△△▲▲□□高频率给药组25.36±0.8219.87±0.72**△△▲▲□□■■9.99±0.62**△△▲▲□□■■6.12±0.82**△△▲▲□□■■2.01±0.60**△△▲▲□□■■

**P<0.01，与空白凝胶组比较；△△P<0.01，与模型组比较；▲▲P<0.01，与对照组比较；□□P<0.01，与低频率给药组比较；■■P<0.01，与中频率给药组比较

2.2.5 组织病理学变化 连续给药4 d后处死大鼠，分别切取各组大鼠溃疡处组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，光学显微镜下观察各组口腔溃疡形态[5]。给药4 d后，模型组和空白凝胶组组织损伤仍较严重，病理损伤涉及黏膜下层，溃疡表面有坏死组织覆盖，大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。对照组和低频率给药组上皮组织愈合良好，但黏膜下层仍有大量炎症细胞浸润。中频率给药组和高频率给药组上皮组织愈合良好，仅少量炎症细胞浸润，具体见图3。

图3 各组大鼠口腔溃疡组织病理学变化(×200)Figure 3 Pathological changes in oral ulcer tissues of the rats in different groups(×200)A:模型组;B:空白凝胶组;C:对照组;D:复方硫酸新霉素温敏凝胶高频率给药组;E:复方硫酸新霉素温敏凝胶中频率给药组;F:复方硫酸新霉素温敏凝胶低频率给药组

3 讨 论

口腔溃疡是口腔黏膜疾病中发病率较高的一种疾病，多由于饮食作息不规律、心理压力大、 紧张疲劳、体虚及免疫力低下等原因引起[6]。主要表现为口腔黏膜出现圆形或椭圆形的溃疡， 呈淡黄色或白色，中央凹陷，边缘整齐，周围绕以红晕，可单发或多发，可发生于口腔黏膜的任何部位[7,8]。目前虽有多种治疗方法，但还没有特效治疗药物，以局部对症治疗为主，以消除致病诱因、促进机体健康、缓解局部症状、促使溃疡愈合、延长间歇期作为治疗目的[9]。复方硫酸新霉素口腔溃疡涂膜主要由硫酸新霉素、盐酸达克罗宁、乙酸地塞米松、维生素E等药物组成，具有消炎止痛，促进溃疡愈合的作用，适用于各型口腔溃疡的治疗，能明显缩短溃疡的病程和延长复发间歇期，减轻病人的痛苦和不适。之前复方硫酸新霉素口腔溃疡涂膜用于临床的剂型是糊剂，临床应用过程中存在的主要问题是给药不方便，影响了药效的发挥。

温敏凝胶是一种越来越受到青睐的新型载药系统，它以溶液状态给药后，可立即在用药部位转化成非化学交联半固体凝胶，延长药物的作用时间，提高疗效[10-11]，用药部位可以维持稳定、有效的药物浓度，减少给药次数，提高病人依从性，减轻全身不良反应。本研究以P407和P188为载体材料，制备复方硫酸新霉素温敏凝胶，在保留原复方硫酸新霉素口腔溃疡涂膜有效成分的基础上，将原有糊剂剂型改进为温敏凝胶剂，处方组成简单、疗效确切，克服了原涂膜的不足。

临床上表现为口腔溃疡的疾病主要有两类：口腔黏膜病引起的口腔溃疡和创伤性溃疡。两者口腔溃疡的发病因素不同，但溃疡病理变化过程和愈合过程基本一致。因此本研究采用化学药物烧灼大鼠下唇内侧黏膜，制备口腔溃疡模型进行实验，结果与模型组比较，复方硫酸新霉素温敏凝胶各频率给药组溃疡面积显著减小，溃疡面愈合良好，提示复方硫酸新霉素温敏凝胶对溃疡有促进愈合的作用。