外泌体的功能及其在肿瘤诊疗中的应用

鲁 悦，戴 琪，武 鑫，任福正*

(1.华东理工大学药学院，上海 200237；2.上海维洱实验室，上海 200433)

外泌体(exosomes)广泛存在于人体的各种体液中，是一种由细胞主动分泌的纳米级囊泡，内含多种蛋白质和核酸分子，在细胞间信息传递的过程中起着重要作用。外泌体是由Johnstone等[1]从绵羊网织红细胞中首次分离纯化得到，过去人们认为外泌体是细胞向外界排出的废物，但近年来研究发现，外泌体的活动在肿瘤细胞与其微环境的信息传递过程中发挥重要作用，调节肿瘤的发生、发展。进一步深入研究发现，肿瘤细胞分泌的外泌体(即肿瘤外泌体)成分特殊，可以用作肿瘤检测的生物标记物。此外，外泌体独特的结构也使其适用于靶向药物传递系统的构建，有助于实现抗肿瘤药物的靶向传递。本文将从外泌体的来源及生物学功能入手，详细综述外泌体在肿瘤靶向诊疗中的应用。

1 外泌体的来源

外泌体是一种由细胞主动分泌的膜囊泡，直径为40～100 nm，广泛存在于尿液、精液[2]、唾液[3]、血液[4]等多种体液中。外泌体的形成从细胞膜内陷形成早期内涵体(early endosome)开始，随后mRNA、蛋白质分子等开始在早期内涵体内聚集，早期内涵体在转运所需的内吞体分选复合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)及其他相关蛋白质的调控下形成多泡体(multivesicular bodies，MVBs)[5]。ESCRT是一系列的胞浆蛋白复合物，包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ及ESCRT-Ⅲ[6]。关于多泡体的形成机制，目前在学术界尚无定论。多泡体与细胞膜融合后，以囊泡形式向细胞外释放细胞内部物质，这些囊泡即为外泌体[5]。

2 外泌体的成分和生物学功能

外泌体通常携带有mRNA、microRNA、DNA、蛋白质等物质，其最主要的生物学功能是实现细胞间信息传递及免疫应答。当外泌体与靶细胞膜融合，其内含物会被传递至靶细胞，实现细胞间的物质交流和信息传递，从而调控细胞的生长。研究发现，前列腺癌细胞来源的外泌体转运的致癌因子与前列腺癌患者脂肪干细胞致癌重编程密切相关，这些致癌因子包括H-ras和K-ras转录物、miR-125b、miR-130b和miR-155，以及GTP酶的Ras超家族 Rab1a、Rab1b和Rab11a[7]，表明肿瘤外泌体在正常细胞癌变的过程中起到积极作用，促进肿瘤的生成。此外，肿瘤外泌体可通过转运与肿瘤血管新生相关的转录调节分子，帮助内皮细胞生长，促进肿瘤血管新生[8]。肿瘤外泌体携带的miR-9可以通过影响人乳腺纤维细胞的性质，促进正常纤维细胞向肿瘤相关的纤维细胞转化[9]，加速肿瘤发展。肿瘤外泌体还具有免疫调节特性，可通过与T调节细胞(regulatory T cells)相互作用，增强T调节细胞对细胞凋亡的抗性，协助肿瘤细胞逃避免疫系统的监视[10]。

3 外泌体在肿瘤诊断中的应用

正常细胞与肿瘤细胞都会分泌外泌体，但是肿瘤外泌体与正常细胞来源的外泌体内含物成分差异巨大，检测肿瘤外泌体所含的蛋白质和核酸分子，有助于提高肿瘤诊断的特异性和灵敏性。因此，体液中的肿瘤外泌体可被当作“液体活检”的重要组成成分。研究发现，血浆外泌体中的miR-221、miR-191、let-7a、miR-181a和miR-26a可作为肝脏特异性miRNA表达标准化的最佳基因参照，从而可作为生物标记物用于诊断早期肝癌[11]；在前列腺癌患者的尿液中，miR-483-5p表达水平较高[12]；CD44v6、Tspan8、EpCAM和CD104 四种表面蛋白，及miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306四种miRNA在胰腺癌患者血清外泌体中有较高的表达水平[13]。这些研究表明，血浆或血清外泌体所携带的miRNA等物质有望成为癌症临床检测的生物标记物，用于肿瘤的诊断。

4 外泌体在肿瘤靶向治疗中的应用

4.1 作为药物载体 近年来，实现抗癌药物的靶向传递一直是新药研究的热点。粒径<200 nm的纳米粒在肿瘤部位有更长的保留时间，因此通常表现出更高效的肿瘤富集效应，这一现象被称作高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)[14]。由于肿瘤组织具有EPR效应，因此纳米粒是一种比较理想的抗肿瘤药物靶向载体。外泌体作为天然的细胞间信息交流使者，有纳米级粒径，再加上其良好的生物相容性，避免了脂质体等人造载体的药物过早泄漏及引发体内免疫反应等缺点，在药物载体领域有更好的优势和更广阔的应用前景。外泌体作为药物载体在血液中稳定性高，免疫源性低，药物运输效率高，归巢靶组织能力和穿过生物屏障能力较强。外泌体的载药方式有两种，一种是在外泌体分泌前载药，包括转染、共孵育等方法；另一种是在外泌体分泌后载药，包括直接混合、电穿孔等方法。外泌体不仅可用于传递小分子化学抗肿瘤药物，也可用来传递mRNA、miRNA、siRNA等基因药物，通过调节细胞间的信息传递来调控肿瘤的发展。研究发现，将外泌体用于传递紫杉醇[15]、阿霉素[16]等小分子化学抗肿瘤药物时，不仅可以降低药物毒性，还可以提高药物在体内的生物利用度。此外，也有学者利用成熟树突状细胞来源的外泌体装载蛋白质类药物，引发免疫细胞的抗肿瘤反应，并尝试以外泌体为基础发展肿瘤疫苗[17]。

利用外泌体的靶向性来装载抗肿瘤药物，减少其对正常细胞的损害，常见方法有以下几种。(1)利用外泌体表面蛋白与受体细胞上的受体结合。研究发现，树突状细胞来源的外泌体能被小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)主动捕获[18]，将黑色素瘤细胞外泌体注射进小鼠体内后，外泌体会集中分布于注射点附近的淋巴结中[19]，这些靶向作用与外泌体膜上存在的复杂而特殊的蛋白质有关。此外，由于肿瘤微环境中的血管内皮细胞间隙较大，有利于外泌体透过细胞间隙渗出血管而滞留于肿瘤组织中，被特定的肿瘤细胞摄取，实现外泌体的被动靶向作用。(2)利用基因工程对外泌体膜进行修饰。由于外泌体自身靶向性较弱且难以控制，利用基因工程技术对其进行修饰是使外泌体获得主动靶向性的重要手段之一。Ohno等[20]利用基因工程技术制备GE11靶向肽修饰的外泌体(GE11-Exos)，并用其将肿瘤抑制性miRNA传递至高表达EGFR的乳腺癌组织中，结果显示，GE11-Exos在体内有良好的靶向性。Alvarez-Erviti等[21]利用基因工程技术修饰树突状母细胞，使其分泌的外泌体膜上含有能够与神经细胞膜上Lamp2b蛋白靶向性结合的狂犬病病毒糖蛋白(rabies viral glycoprotein,PVG)多肽，从而实现外泌体靶向给药。此外，还有研究者利用叠氮-脂[22]或聚乙二醇类似物[23]连接在外泌体膜，以增强外泌体中抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤力，延长其在体内的循环时间。(3)利用磁纳米颗粒技术对外泌体进行修饰。该技术是将具有超顺磁性的纳米粒与外泌体制得的复合物用作肿瘤药物的靶向载体。Qi等[24]利用血清外泌体表面的转铁蛋白受体和转铁蛋白特异性结合，将超顺磁粒子和小鼠血清共同孵育，使超顺磁粒子与外泌体表面的转铁蛋白结合，再通过外加磁场收集外泌体并完成载药后,注入小鼠体内，最后通过在肿瘤部位外加磁场实现外泌体的靶向作用。

4.2 作为肿瘤治疗靶标 由于外泌体在细胞间传递信息，调控肿瘤微环境，促进肿瘤组织血管新生及肿瘤转移，因此抑制肿瘤外泌体的活动为肿瘤的靶向治疗提供了新思路。向Lewis肺癌荷瘤小鼠模型腹腔注射GW4869S(中性鞘磷脂酶2抑制剂)，可降低Lewis肿瘤细胞外泌体的分泌，从而抑制肺癌细胞转移[25]。在黑色素瘤细胞中，调控外泌体囊泡形成的RAB27A基因有较高表达，研究发现，通过RNA干扰该基因的表达能有效减少黑色素瘤细胞外泌体的分泌，从而抑制黑色素瘤的生长和转移[26]。这些研究结果均提示，控制外泌体的分泌可能成为肿瘤治疗的新靶标，可以通过抑制外泌体的分泌达到治疗肿瘤的目标。

5 展 望

综上所述，外泌体成分与肿瘤的发生发展关系密切。目前，将外泌体作为肿瘤检测的生物标记物以及肿瘤治疗的靶向载体仍是新药研发的热点。外泌体的磷脂双分子层结构可以保护其内含物在血液内长时间稳定地转运，再加上其纳米级的粒径，外泌体被用作抗肿瘤药物载体也有广阔的应用前景。经生物技术对外泌体表面进行修饰，使其具有很大的潜力成为抗肿瘤药物的靶向载体。外泌体中包含的蛋白质、核酸分子常被用作肿瘤检测的生物标记物，但是由于外泌体内所含成分复杂，且不同来源的外泌体中蛋白质和核酸分子的表达水平差异较大，因此将外泌体作为癌症诊断的生物标记物仍处于实验室研究阶段，若想投入临床应用，还需要克服诸多难题。并且外泌体产率较低， 对药物的包封率也不甚理想， 不同细胞来源的外泌体成分差异巨大， 因此将外泌体作为抗肿瘤药物的靶向载体还需要更多的探索。 总之， 外泌体用于肿瘤的生物检测及抗肿瘤药物的靶向载体有着广阔的前景， 但仍需要深入探索。