不同瓣型腾冲红花油茶的遗传多样性与遗传结构分析

甘沛华 李 旦 沈德周 周安佩 谢忠利 何承忠，4

( 1. 西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650233；3. 西南林业大学云南生物多样性研究院，云南 昆明 650233；4. 西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650233)

腾冲红花油茶（Camellia reticulatef.simplex）隶属于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），是云南山茶花的原始种，被列为国家二级珍稀保护物种[1]。前期资源调查结果表明，腾冲红花油茶属于窄分布种，为局限性生态幅物种[2]，自然分布范围仅限于滇西山地及滇中高原[3]，而其原始天然林集中分布于保山市昌宁县、腾冲市、隆阳区，大理州永平县、云龙县、南涧县、巍山县，临沧市凤庆县，丽江市华坪县，楚雄州楚雄市[4]。其中，腾冲市打云山以及大麓丛山周围的云华、中和、固东和曲石等乡镇分布着极其丰富的腾冲红花油茶天然野生种群，该区域也是云南山茶的故乡和起源地[1，5-7]。腾冲红花油茶的茶油中不饱和脂肪酸含量高达85%，品质优良，是一种优质耐储藏的食用油[4，8]。同时，长期在自由授粉、天然杂交、分布区小气候类型多样等自然因素的综合作用下，形成了缤纷多样的花型和花色，为云南八大名花之一的“山茶花”优良观赏品种培育提供了丰富的育种资源[9-11]。因此，腾冲红花油茶不仅是云南特有的优良木本油料树种，又由于花型多样，花色丰富，也是观赏价值很高的园林绿化树种，具有巨大的开发利用潜力和经济价值。

腾冲红花油茶的主要观赏器官是花朵。在20世纪30年代，英国植物学家Geerge Forrest将腾冲采集到的单瓣类型腾冲红花油茶命名为C.reticuletavar.simplex，并认为是云南山茶的原始种，而Sealy于1958年将腾冲红花油茶拉丁名修订为C. reticuletaf.simplex[12]。因此，腾冲红花油茶最初是指单瓣类型。之后，俞德浚等[13]又根据花瓣轮数，初步将腾冲红花油茶分为单瓣、半重瓣和重瓣3个类型，在此基础上，根据花瓣数及其轮数，具体划分为单瓣组、半重瓣组和重瓣组[1]，司马永康等[10]利用计算机技术，采用直接观察计数、数理统计和数量分类学的方法，将云南红花油茶划分为腾冲红花油茶、云南红花油茶、重瓣红花油茶和叠瓣红花油茶4个变种。沈立新等[9]以花、果性状与形态、用途及经济价值为依据，将腾冲红花油茶划分为单瓣花系、半重瓣花系、重瓣花系3个自然类型，进一步根据果形特征等将单瓣花系细分为5个品种类群，根据花的形态特征等将半重瓣和重瓣花系分别细分为5个和10个品种类群。上述分类主要依据表型性状，而表型是基因与环境共同作用的结果，受环境条件影响明显，表现出较大的可塑性。

AFLP分子标记技术能够准确地开展物种鉴别、遗传多样性分析以及系统发育关系建立等，具有较好的稳定性和可重复性[14-17]。然而，从分子层面对不同瓣型腾冲红花油茶的遗传多样性研究尚为空白。为此，本研究以采集于腾冲市腾冲红花油茶天然野生种群和种质资源收集保存基地的3个自然类型90株个体为材料，采用AFLP分子标记技术揭示其遗传多样性和遗传结构，以期阐明腾冲红花油茶遗传变异水平和遗传变异规律，为种质资源的收集与保存提供科学依据，为类型的划分提供分子证据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

依据沈立新等[9]对腾冲红花油茶单瓣、半重瓣与重瓣3个自然类型的划分，在盛花期从腾冲市腾冲红花油茶天然野生种群及种质资源保存基地中按不同类型采集样本，每个类型采集样本30份，共计90份样本。天然野生种群中同一类型的样株间隔在30 m以上。采集嫩叶，用变色硅胶快速干燥处理，带回实验室备用。各样本详细信息见表1。

表 1 测试样本信息Table 1 Information of the test samples

1.2 测试样本总DNA提取

依照Ezup plant genomic DNA prep Kit（上海生工）说明书的步骤提取测试样本总DNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，通过核酸蛋白检测仪Agilent 2100（Agilent Technologies，CA，USA）对DNA的纯度和浓度进行检测，稀释至50 ng/μL的终浓度，于-20 ℃保存，备用。

1.3 AFLP体系

采用EcoR I +MseI限制性内切酶组合对测试样本的总DNA进行双酶切，取4 μL双酶切产物连接E-adaptor和M-adaptor。以添加接头后的产物4 μL为模板，采用E00+M00引物组合进行PCR预扩增，将预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增模板。选择性PCR扩增引物组合方式为E+3+M+3。取选择性扩增产物5 μL与双指示剂（溴酚蓝+二甲苯青）充分混合后上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，进行选择性扩增引物的筛选。参照IRDyeTMFluoresecent AFLP Kit说明书对筛选出的选择性扩增引物锚定荧光标记，荧光AFLP选择性PCR扩增产物在LI - COR 4300 DNA测序仪上进行毛细管电泳分离。PCR扩增均在PTC-100TMThermal PCR仪上进行。

1.4 数据统计与分析

应用GeneMarker V2.2.0对所得数据进行人工校对，统计不同样本同一位置峰值的“有” “无”，转换为1/0数据矩阵。采用POPGENE 1.32软件[18]对腾冲红花油茶的3个自然类型的多态性条带百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon’s信息指数（I）、Nei’s总基因多样度（Ht）、类型内基因多样度（Hs）、遗传分化系数（Gst）、基因流（Nm）以及类型间的Nei’s遗传距离等参数进行计算。运用AMOVA软件[19]进行3个类型间的分子方差分析。应用MEGA5.0软件[20]基于Nei’s遗传距离分别构建3个自然类型和90个样株的UPGMA聚类图。

2 结果与分析

2.1 腾冲红花油茶3个自然类型的遗传多样性

筛选出7对AFLP引物组合用于腾冲红花油茶3个自然类型共90份样本的遗传变异分析，共扩增得到有效条带697条，其中多态性条带百分率（PPB）为100%，有效等位基因数（Ne）为1.361 4，基因多样性指数（H）和Shannon’s信息指数（I）分别为0.257 6和0.421 5，表明腾冲红花油茶具有丰富的遗传多样性。3个自然类型之间，多态性条带百分率（PPBnfp）变化范围为99.14%～99.71%，平均为99.47%，半重瓣类型的多态性条带百分率最高，而单瓣类型最低；有效等位基因数（Nenfp）变幅为1.347 9～1.377 0，平均为1.361 6，基因多样性指数（Hnfp）和Shannon’s信息指数（Infp）分别介于 0.241 8～0.255 8和0.395 9～0.413 2之间，均值分别为0.248 7和0.404 7，该3个参数的最大值均出现在单瓣类型，最小值为重瓣类型（表2）。以基因多样性指数为参照，3个自然类型的遗传多样性水平依次为单瓣类型 ＞半重瓣类型 ＞重瓣类型。

表 2 腾冲红花油茶3个自然类型的遗传多样性Table 2 Genetic diversity of 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex

2.2 腾冲红花油茶自然类型的遗传结构

POPGENE分析结果显示，腾冲红花油茶的总基因多样度（Ht）为0.257 6，自然类型内的基因多样度（Hs）为0.248 7，不同自然类型之间的基因流（Nm）为13.99，说明不同自然类型之间的基因交流频繁，不存在基因交流的屏障。遗传分化系数（Gst）为0.034 5，表明自然类型之间的遗传变异仅占总变异的3.45%，而96.55%的遗传变异存在于自然类型内的不同个体之间。应用AMOVA软件对3个自然类型遗传变异的分子方差分析结果（表3）显示，不同自然类型间的基因分化系数（Φst）为0.056，变异组分为7.76，变异占总变异的5.59%，而自然类型内的变异占总变异的94.41%。POPGENE和AMOVA分析结果均表明，自然类型内不同个体之间的遗传差异是腾冲红花油茶遗传多样性的主要来源。

表 3 腾冲红花油茶3个自然类型的AMOVA分析Table 3 Analysis of molecular variance among 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex

2.3 遗传距离与聚类分析

为揭示腾冲红花油茶3个自然类型在不同层次上的差异变化，分别以自然类型和个体作为分析基本单元进行遗传距离的统计分析。由表4可见，以自然类型为基本单元时，3个自然类型之间的遗传距离变幅为0.016 1～0.021 3，平均为0.017 9，半重瓣类型与重瓣类型之间的遗传距离最小，其次为单瓣类型与半重瓣类型之间，而单瓣类型与重瓣类型之间的遗传距离最大。UPGMA聚类结果显示，在遗传距离0.008 2处，3个自然类型聚为2个大组，第1组由半重瓣类型和重瓣类型构成，第2组仅有单瓣类型（图1），半重瓣类型和重瓣类型可能由单瓣类型演化而形成。

表 4 腾冲红花油茶3个自然类型间遗传距离Table 4 Genetic distance among 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex

以腾冲红花油茶样本单株为基本单元进行分析，3个自然类型的90个个体之间的遗传距离介于0.268 3～0.671 9，平均为0.498 1。其中，单瓣类型30个单株之间的遗传距离变幅在0.268 3～0.606 6，平均为0.481 9；半重瓣类型个体之间的遗传距离变化范围为0.279 6～0.588 4，平均为0.475 6；重瓣类型样株间的遗传距离介于0.344 2～0.638 6之间，平均为0.463 3。单瓣类型的单株间遗传距离变幅最大，说明其个体遗传差异较大，遗传背景较丰富。基于90个个体间的遗传距离UPGMA聚类结果（图2）显示，90个腾冲红花油茶单株主要聚分为3个大组，第1组由单瓣类型16个个体（53.33%）构成，第2组包含有单瓣类型14个个体（46.67%）和半重瓣类型19个个体（63.33%），第3大组包含半重瓣类型5个个体（16.67%）和重瓣类型27个个体（90.00%）。由此可见，腾冲红花油茶的单瓣类型、半重瓣类型和重瓣类型具有各自的遗传物质基础，其3个自然类型划分具有科学性和合理性，且半重瓣类型为单瓣类型和重瓣类型的过渡类型。

图 1 基于Nei’s遗传距离的腾冲红花油茶3个自然类型聚类Fig. 1 UPGMA dendrogram among 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex based on Nei’s genetic distance

图 2 基于Nei’s遗传距离的腾冲红花油茶90个单株聚类Fig. 2 UPGMA dendrogram among 90 individuals of C. reticulata f. simplex based on Nei’s genetic distance

3 结论与讨论

前期调查结果表明，腾冲红花油茶的花型与花色[9-11]、果实形态[8，21-24]、以及茶油成分组成[8，25-26]等均存在较大的变异，种质资源的遗传背景十分丰富。Xin等[27]采用AFLP标记技术对采自云南省5个群体190份样本云南山茶遗传多样性进行了分析，4对AFLP引物共扩增出387条带，其中多态性条带百分率为100%，基因多样性指数（H）为 0.339 7，Shannon’s信息指数（I）为 0.523 6，且群体内的遗传变异（96.31%）高于群体间的遗传变异（3.69%）。Wang等[28]应用ISSR标记技术对收集于云南省和四川省各3个群体共114个样本的云南山茶（C. reticuleta）遗传变异进行了研究，7对引物扩增得到108条带，多态性条带百分率为88.89%，H和I分别为0.280 9和0.427 8，群体间遗传分化系数为0.380 7。刘婵[29]应用ISSR标记技术分析了收集于腾冲市的46个山茶花品种遗传多样性，17对引物扩增出193个位点，其中多态性位点183个（94.8%），17对引物的平均I为2.628。本研究采用荧光AFLP分子标记技术，筛选出7对引物组合从90份样本中扩增得到有效条带679条，多态性条带百分率（PPB）为100%，有效等位基因数（Ne）为1.361 4，H为0.257 6，I为0.421 5，遗传分化系数（Gst）为0.034 5。腾冲红花油茶的遗传多样性参数相同或略低于云南山茶，可能是腾冲红花油茶的分布区域较狭窄，仅分布于云南省楚雄州、保山市、大理州、临沧市和丽江市的部分区域，且较集中分布于腾冲市境内，而云南山茶的分布区域从云南省的滇中、滇西、滇西北地区延伸至四川省的凉山州、攀枝花市以及贵州省的部分地区。但腾冲红花油茶与云南山茶的遗传变异规律相同，均为群体内的遗传变异大于群体间的遗传变异。因此，加强对其现存个体的保护，将是保护腾冲红花油茶遗传多样性的有效措施。

本研究采用AFLP分子标记技术，对依据单瓣、半重瓣和重瓣3个自然类型分类系统采集的各类型30份样本共计90个单株基于Nei’s遗传距离进行聚类分析，单瓣类型的30个个体被聚分为2个分支，16个单株处于同一分支，其余14个单株与半重瓣类型19个单株聚于一个分支，而重瓣类型的27个单株与半重瓣类型5个单株相聚构成一个分支。由此可见，单瓣、半重瓣和重瓣类型在DNA水平存在差异，具有各自独特的遗传物质基础，表明腾冲红花油茶划分为单瓣、半重瓣和重瓣3个自然类型具有一定的科学性和合理性。同时，本研究结果也支持半重瓣为单瓣与重瓣腾冲红花油茶的过渡类型[9，11]。而将云南红花油茶划分为腾冲红花油茶（C. reticulatef.simplex）、云南红花油茶（C.reticulatevar.reticulate）、重瓣红花油茶（C.reticulatevar.pleiopetala）和叠瓣红花油茶（C.reticulatevar.Pleistopetala）4个变种是否具有分子水平依据，有待于进一步研究。