DNA甲基化与子宫内膜异位症内膜容受性的研究进展

阮蒙佳 程 静

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是常见的妇科良性疾病，有10%～15%的育龄妇女患有EMS[1]。EMS直接影响女性的生育功能，不孕妇女中EMS的发病率高达35%～50%[2]，此外EMS患者合并不孕的发生率达30%～50%。EMS存在多种可能造成生育能力低下的机制，包括卵泡发育改变、卵母细胞质量差、受精能力受损、植入缺陷、植入能力降低等。对EMS患者行体外受精(invitrofertilization，IVF)后胚胎移植(embryo transfer，ET)，移植率高达85%，但临床妊娠率仅20%，提示子宫内膜容受性下降导致的胚胎着床缺陷可能是EMS患者不孕的主要原因之一。

子宫内膜容受性是子宫内膜对胚胎的接纳能力，包括胚胎黏附至完成着床的过程，该特定阶段依赖卵巢激素刺激，因此具有严格的时间和空间限制性。这一功能性和短暂性的阶段被称作窗口期，在人类通常认为是分泌期中促黄体素(luteinizing hormone，LH)峰后的6～10 d，持续时间约48 h[3]。子宫内膜容受性可由外周激素、细胞因子、同源框(homeobox，HOX)基因、骨桥蛋白、DNA甲基化、微RNA(miRNA)等因素调控。

1 DNA甲基化与EMS

1.1 DNA甲基化 表观遗传学是指在不改变DNA碱基排列顺序的情况下影响基因表达。DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA、基因组印记等为常见的表观遗传调控机制。DNA甲基化是指在真核生物基因组中胞嘧啶的5’C端添加1个甲基，使其形成5-甲基胞嘧啶的修饰过程；对于哺乳动物，这种修饰主要存在于胞嘧啶-鸟嘌呤双核苷酸(CpG sites)之间，当启动子(promoter)的CpG岛(CpG island)发生甲基化时，相关基因由于转录活性受抑制而沉默表达。DNA甲基化是人类基因组的一种重要的表观遗传修饰，在细胞分化、基因表达、基因组印记和诸多其他细胞调控过程中发挥重要作用。

在真核生物中，DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNMTs)催化，目前已知DNMTs包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1主要负责维持DNA甲基化状态，而DNMT3a、DNMT3b则主要参与新甲基化位点的形成[4-5]。

1.2 EMS中DNA甲基化异常 DNA甲基化作为表观遗传学修饰方式之一，是近年来研究的热点。异常的DNA甲基化通常被认为是肿瘤和其他多种疾病发生的重要机制，研究表明其在EMS患者患病过程中也发挥重要作用。EMS患者中异常表达的DNMTs通常被认为是引起DNA甲基化异常的决定性因素。既往Wu等[6]的研究结果表明，与对照组相比，EMS患者异位内膜中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达均升高。但杨娟等[7]的研究发现，EMS患者异位和在位内膜中DNMTs的表达均低于正常对照组。近期Hsiao等[8]的研究表明，由于DNMT1的下调，子宫内膜基质细胞的基因组在全局范围内都是低甲基化的。造成上述差异的原因可能与子宫内膜上皮细胞与间质细胞未进行分离检测，以及患者间的遗传异质性有关。

另有众多研究表明，在EMS与子宫内膜上皮细胞和基质细胞中特定基因的低甲基化和高甲基化都有关，例如：高甲基化的基因有HOX、孕激素受体(PR)-B、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等，前两者与子宫内膜容受性密切相关，后者与异位内膜的侵袭和转移关系紧密；低甲基化的基因有雌激素受体(ER)-β、类固醇生成因子-1(steroidogenic factor-1，SF-1)、芳香化酶(aromatase)，它们作为人体类固醇激素合成和发挥作用的关键要素，参与并促进异位内膜组织存活与扩增。

异常的DNA甲基化通过作用于子宫内膜中某些基因的表达，从而影响子宫内膜的容受性，可能是EMS患者不孕的重要原因。

2 ER和PR

2.1 雌、孕激素 雌激素和孕激素均为类固醇激素，是子宫内膜组织的主要调控因子，它们在月经周期的不同阶段调控数百个基因的表达。雌、孕激素与子宫内膜上相应的受体结合，通过介导信号转导，调控基因表达。其介导作用涉及多种生殖功能，包括胚胎植入、滋养细胞侵袭、蜕膜化，以及随后功能性胎盘的形成，这些都对妊娠的建立和维持至关重要。其中下游信号包括HOXA10、FOXO1、CCAAT-增强子结合蛋白(C/EBP-β)等，这些信号调节细胞分化，促进子宫内膜容受性建立与胚胎植入[9]。近年来研究显示，EMS患者体内的雌、孕激素水平均正常，但可能由于某些受体的改变，导致雌、孕激素介导的蜕化信号通路产生异常，从而影响子宫内膜容受性和胚胎植入。

2.2 ER的DNA甲基化 ER有ER-α和ER-β两种亚型，在异位子宫内膜和正常内膜中均有表达。ER-α/ER-β比值的改变可能会改变细胞对雌激素的接受能力。Bulun等[10]研究发现，EMS患者中DNMT1的下调可能导致ER-β基因区域的低甲基化，从而导致ER-β表达增加；ER-β又被证明与ER-α的启动子位点结合，使其活性下调；ER-α可以调节PR基因的表达，因此ER-α表达的降低会导致PR水平的降低，进而产生孕激素信号缺失和孕激素抵抗，不利于子宫内膜容受性的建立[11-12]。

Talbi等[13]研究发现，在分泌中期，正常子宫内膜ER-α下调，雌激素水平下降，可能在激活着床中发挥关键作用。另有研究[14]结果表明，部分EMS患者的窗口期存在过度表达的ER-α，这可能损害了子宫内膜容受性。上述两个结论存在差异可能与所研究的组织位置和疾病发生的时间有关。Han等[15]推测可能是孕激素抵抗降低了ER-α表达，所以EMS患者早期子宫内膜组织可能比晚期组织携带更多的ER-α。

综上，雌激素通过与ER结合，介导多种信号(包括PR)而产生转录效应，这对子宫内膜容受性的建立至关重要。异常的DNA甲基化可能是使EMS子宫内膜中ER-α/ER-β比值发生改变，导致内膜容受性受损的表观遗传机制之一。

2.3 PR的DNA甲基化 PR属于核受体家族。孕激素通过与PR相结合，调控某些特定基因表达而发挥生理作用。PRs对妊娠早期的成功至关重要，EMS患者子宫内膜DNA甲基化的异常可能会影响早期PR维持妊娠的成功率。

蜕膜化指子宫内膜基质成纤维细胞分化形成蜕膜，蜕膜组织的形成对于妊娠的建立和维持至关重要。蜕膜化过程要求间质细胞中环磷酸腺苷(cAMP)水平升高，进而诱导或激活其下游蜕膜化诱导因子，如HOXA10、FOXO1、C/EBP-β等的表达，从而作用核受体的转录功能，最终完成内膜蜕膜化。而PR参与了与这些蜕膜化因子的相互作用，使其发挥效应，因此PR在内膜容受性的形成中起关键作用。既往研究证实EMS发展与不完全蜕膜过程之间存在重叠遗传特征。

PR有两种亚型，PR-A主要表达于子宫组织和卵巢，而PR-B则更多地参与乳腺发育。研究[16-17]表明，PR-A敲除小鼠因孕激素调节基因表达缺失而导致胚胎植入缺陷；然而，敲除PR-B的小鼠有生育能力，并且能维持正常妊娠。由此推断PR-A与小鼠生殖的关系更为密切，但此结论能否外推到人仍待证实。

在正常的人子宫内膜上皮细胞中，随着增殖期雌激素水平升高，PR-A、PR-B水平均升高，但在分泌期随着血清孕激素水平上升而降低，PR-A/PR-B在整个正常月经周期中保持不变。PR-A/PR-B比值的改变可能是EMS患者发生孕激素抵抗的机制之一。Nasu等[12]在小鼠和狒狒EMS模型中观察到子宫内膜中PR-A水平降低，PR-B/PR-A升高，总PR蛋白表达量较对照组增加。Fazleabas等[18]的研究结果表明，中、重度EMS患者子宫内膜内总PR水平呈升高趋势。这种PR表达的改变可能导致孕激素反应减弱和PR表达减少。但是Samartzis等[19]的研究结果表明，与正常妇女相比，不同类型EMA患者的上皮细胞中总PR表达量下降更为常见。绝大多数研究[20-22]结果表明，EMS患者在位内膜中PR-B基因发生高度甲基化，使其表达量显著下降，PR-B/PR-A比值降低，PR蛋白总表达量下降，从而影响异位病灶对孕激素的反应，产生孕激素抵抗。也有研究[23]表明，孕激素抵抗是影响EMS患者子宫内膜容受性并造成其不孕的重要原因。

2.4 孕激素抵抗 正常人和EMS患者体内的雌、孕激素水平正常，且内膜组织均表达PR，但EMS患者内膜中受体产生表观遗传改变，进而产生分子水平上的孕激素反应减弱或失调，称之为孕激素抵抗，在EMS患者中出现比率高达9%[20]。

泌乳素表达作为孕激素介导的反映子宫内膜间质细胞蜕膜化程度的分子标记之一，早期研究检测到异位内膜中间质细胞泌乳素mRNA显著下降，从而表明异位病灶中存在孕激素抵抗，导致间质蜕膜化不佳。Kao等[24]的研究同样显示，EMS患者在位内膜分泌期由孕激素介导的一系列下游基因表达下调。以上研究结果均表明，EMS患者存在孕激素抵抗现象。导致EMS患者不孕的原因众多，其中孕激素抵抗导致的子宫内膜与受精卵发育不同步和子宫内膜容受性降低是影响胚胎植入的关键原因之一。

孕激素与子宫内膜容受性关系密切，也可抑制异位内膜的生长和炎性反应。因此，孕激素抵抗使内膜容受性下降，直接影响生殖，也使临床上使用孕激素类药物缓解EMS患者的慢性盆腔疼痛、痛经等症状的疗效甚微。

综上，EMS患者子宫内膜中ER和PR的异常DNA甲基化可作为其子宫内膜容受性下降的原因之一。此外，孕激素结合受体激活的下游信号包括HOXA，对子宫内膜容受性也产生相关影响。

3 HOX基因

HOX基因首先在果蝇体内被发现，它通过保守的同源域作为转录调控因子来控制胚胎形态发生。最初认为HOX基因只在胚胎发育过程中表达，但后续研究发现HOX基因编码同源域转录因子，在子宫内膜中表达呈现动态趋势，作为内膜生长、分化和胚胎植入的必要因素之一。人的HOX基因可分为A、B、C、D共4个基因簇。HOXA基因与生殖道发育和功能关系密切，其中HOXA9和HOXA13分别主要表达于输卵管和阴道，HOXA10主要在子宫表达，HOXA11则主要在子宫和宫颈表达。本文着重介绍与内膜容受性密切相关的HOXA10和HOXA11。

3.1 孕激素与HOX基因 雌、孕激素均能介导内膜组织中HOXA10、HOXA11的表达上调，且孕激素的调控能力强于雌激素，两者联合作用的效果强于单一激素作用。PR自身异常DNA甲基化产生孕激素抵抗，使其不能有效调控下游靶基因HOXA10和HOXA11的表达，使孕激素在建立子宫内膜容受性中不能发挥有效作用。同时，HOXA10和HOXA11自身的高甲基化也阻碍了孕激素产生调节作用。甲基化的相对永久性可能是子宫内膜容受性下降和治疗EMS相关不孕妊娠率低的可能原因。

3.2HOXA10和HOXA11 多项研究表明，HOXA10和HOXA11对小鼠的生育能力都是必需的。虽然HOXA10或HOXA11敲除小鼠产生正常数量的胚胎，并且这些胚胎在野生型代孕小鼠中存活，但是来自代孕小鼠的野生型胚胎不能在HOXA10和HOXA11缺陷小鼠子宫中着床，这表明HOXA10和HOXA11影响了胚胎着床，与小鼠子宫内膜容受性关系紧密。Bagot等[25]发现，在小鼠子宫内注射HOXA10反义寡核苷酸后，胚胎植入率显著下降，也进一步证明了HOXA10在小鼠胚胎植入过程中的重要性。

在人体子宫内膜中，HOXA10和HOXA11的表达是由性激素驱使的，在胚胎植入期出现峰值。在窗口期，雌、孕激素水平升高，通过与子宫内膜上相应的受体结合，激活HOXA10基因的表达，HOXA10参与数以百计基因的调控，这些基因作用于内膜细胞的增殖，间质细胞蜕膜化的发生，内膜分化高峰的形成，使子宫内膜良好容受性得以建立，为胚胎植入提供最佳条件。此外，HOXA10还通过上调子宫内膜间质中色氨酸加氧酶(TDO)的表达来增加色氨酸的代谢，有利于免疫耐受的胚胎植入。因此，HOXA10基因水平可作为衡量子宫内膜容受性建立的基因水平标志物之一。

王丽等[30]的研究表明，使用甲基化转移酶抑制剂(DNMTI)5-氮杂-2’-脱氧胞苷体外原代培养EMS患者子宫内膜上皮细胞，其HOXA10的甲基化水平显著下降，同时伴随HOXA10表达增加，从而进一步调节下游基因的表达，使子宫内膜形成良好容受性。由此证明HOXA10的高甲基化可能是EMS患者HOXA10表达量下调，从而导致内膜容受性受损的潜在表观遗传修饰机制之一。

HOXA基因对子宫内膜的作用，具体体现在其作为转录因子调控下游靶基因的表达。HOXA10调控的下游因子包括胞饮小泡(pinopodes)、αvβ3整合素(integrins)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)、Emx2、P57和FKBP4等，前四者可作为子宫内膜容受性测试和胚胎移植相关的标志物。

4 HOXA10下游基因

HOXA10作为重要的转录调节因子，激活或抑制下游靶基因表达，如胞饮小泡、αvβ3整合素、IGFBP-1、Emx2，它们均对子宫内膜良好容受性的建立至关重要。这些因素可以作为特定于着床窗口的分子和形态学标志物。而异常甲基化的HOXA10表达下调，则会使下游因子的调控发生改变，进而影响子宫内膜容受性。

4.1 胞饮小泡 胞饮小泡是腔上皮顶端表面的胞质突起，可以在扫描电子显微镜下观察到，其内含有向管腔延伸的分泌液泡。胞饮小泡表面可能有黏附分子受体，这对胚胎植入至关重要。胞饮小泡内的线粒体和糖原为胚胎发育和囊胚植入提供能量。Diedrich等[31]进行的临床研究证明，胞饮小泡缺乏患者的胚胎着床率低，而子宫内膜内富含胞饮小泡的女性妊娠成功率高。

胞饮小泡是一种孕激素依赖结构，其出现与窗口期的出现时间一致。移植HOXA10反义基因阻断HOXA10表达后胞饮小泡的数量显著减少，而当子宫HOXA10的表达上调时，可以观察到胞饮小泡增多[32]。因此，胞饮小泡可作为HOXA10介导的子宫内膜功能分化的形态学标记之一。Bartosch等[33]研究了EMS合并不孕症患者排卵前子宫内膜结构，与对照组相比，光学显微镜下患者的腺体数、有核空泡细胞数和基质有丝分裂显著减少，基于胞饮小泡对胚胎植入的相关作用，提示其与EMS患者子宫内膜容受性相关。以上研究结果表明，EMS可能通过DNA甲基化降低HOXA10基因的表达能力，从而影响胞饮小泡的发育，使EMS患者的子宫内膜容受性降低。

4.2 整合素 整合素是细胞黏附分子家族成员之一，参与细胞间、细胞与基底层之间的黏附作用。它能促进细胞对细胞外基质(ECM)中的蛋白质的黏附，并提高细胞的迁移和侵袭能力。普遍认为整合素通过激活内膜亚单位，使内膜血管通透性增加，促进血管释放物质作用于子宫内膜，介导细胞与ECM间的黏附，有利于胚胎的植入。许多整合素家族的成员在整个月经周期子宫内膜均有表达。其中，αvβ3整合素在子宫内膜腔上皮细胞顶端的表达格外关键，它在胚胎植入期表达，即月经周期第20天后的分泌期，是子宫内膜容受性最佳时期，它在最初胚胎与子宫内膜相互作用中起关键作用。吴天思等[34]的实验结果显示，EMS模型组小鼠窗口期子宫内膜αvβ3整合素表达量低于假手术组。但是Casals等[35]的研究结果显示，EMS患者窗口期内膜αvβ3整合素表达水平与输卵管因素或不明原因不孕组间的差异均无统计学意义。EMS患者窗口期子宫内膜腔上皮细胞顶端αvβ3整合素表达量的变化有待进一步确定。

αvβ3整合素高表达水平与高水平的孕激素及其靶点HOXA10相关。此外，HOXA10可以直接监管整合素β3亚单位的表达，孕激素也可通过HOXA10通路调节整合素β3的表达。整合素β3表达峰值与HOXA10峰值吻合。整合素β3沿子宫内膜腔上皮细胞顶端的增加显著，从而增强胚胎黏附能力；整合素β3进一步从黏着斑位点除去子宫上皮细胞使胚胎植入。因此，可能由于HOXA10基因的甲基化下调了HOXA10，直接或间接影响了整合素的表达，降低子宫内膜容受性，进而对胚胎的着床产生影响。

4.3 IGFBP-1 IGFBP-1最初被认为是结合并调节胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ和IGF-Ⅱ的蛋白。人类蜕膜基质细胞表达IGFBP-1。在母胎交界面，蜕膜表达的IGFBP-1与胎儿滋养细胞表达的IGF-Ⅱ之间产生了一种旁分泌相互作用，提供胚胎植入必需的条件。在狒狒和人体子宫内膜间质细胞中，HOXA10通过与FOXO转录因子FKHR相互作用，上调IGFBP-1表达，参与了子宫内膜蜕膜化进程[36-37]。Lee等[38]的实验结果显示，在EMS小鼠模型中，HOXA10发生甲基化，并且检测到作为蜕膜化的标志物之一的IGFBP-1表达下调。同时有研究[39]结果显示，在EMS患者中蜕膜基质细胞分泌的IGFBP-1水平也下降。但是有研究发现，HOXA10上调使患有EMS的狒狒蜕膜细胞IGFBP-1的表达增加。Kim等[37]的实验证明，使用特定的小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸沉默HOXA10后，HOXA10 mRNA表达下降，与对照组相比，IGFBP-1表达明显增加。该实验为EMS患者子宫内膜中HOXA10蛋白的减少可能导致内膜细胞在蜕膜过程中IGFBP-1的表达增加提供了一个潜在机制的证据。众多研究结果显示，EMA患者IGFBP-1水平存在差异，具体结果还有待进一步研究发现。但以上实验结果提示，HOXA10的甲基化导致HOXA10蛋白降低，可能成为IGFBP-1表达明显改变，进而导致内膜容受性下降的机制之一。

4.4Emx2Emx2是人类与果蝇的同源异型盒基因，是首个被证实由HOXA10基因直接参与负向调控的生殖道发育相关因子。Emx2转录产物水平在卵泡期显著上升，至分泌早期达到峰值，但是在胚胎着床期下降半数。抑制Emx2基因表达使子宫内膜细胞增殖、体积增大、发生蜕膜化，以形成胚胎植入的最佳结构基础。Emx2基因转染的小鼠产仔数减少40%。EMS患者子宫内膜HOXA10下调而Emx2表达增加，而后伴随胚胎植入缺陷[40]。由此推断，可能由于EMS患者植入期子宫内膜HOXA10高甲基化使其表达下调，Emx2表达升高，使子宫内膜容受性受损，不能产生良好的着床环境，从而影响胚胎植入。因此，抑制HOXA10的高甲基化，降低Emx2表达，有望成为今后改善EMS患者内膜容受性的治疗靶点之一。

5 相关治疗

子宫内膜异常甲基化使PR-B/PR-A比值发生改变，同时HOXA10甲基化也沉默孕激素靶基因作用，均造成孕激素抵抗。孕激素抵抗成为目前治疗EMS的难点。患者对生理性或外源性孕激素发生抵抗，导致不孕、流产发生率升高，以及孕激素辅助治疗疗效不佳。一种选择性PR调制器药物Asoprisnil被用来治疗孕激素抵抗，但疗效参差不齐。

王丽等[30]使用DNMTI 5-氮杂-2’-脱氧胞苷体外原代培养EMS患者子宫内膜上皮细胞，其HOXA10的甲基化水平下降，同时HOXA10表达上调，从而进一步调节下游基因的表达，促进了子宫内膜容受性的建立。

叶酸是人类体内甲基基团的最终来源，在维持DNA甲基化中发挥着不可或缺的作用。许科[41]通过临床试验证明，EMS患者体内叶酸水平与HOXA10基因表达呈显著正相关，因而推测补充叶酸可能作为降低启动子区甲基化概率，进而促进良好子宫内膜容受性的建立，并阻止EMS发病进程的新方向。

6 结语和展望

子宫内膜容受性的建立作为胚胎植入的关键性因素，是EMS合并不孕患者迫切需要的。综上所述，DNA甲基化本质上是由DNMTs催化的一种可逆的表观遗传修饰，其中尤其是PR-B和HOXA的甲基化，可能作为影响EMS患者内膜容受性的重要因素。采用DNMT1抑制异常甲基化的发生，进行基因靶向治疗，有望从基因水平使EMS发生转归。此外，在DNMT1抑制基因甲基化的过程中，同时调控并改善HOXA10下游相关基因转录，使子宫内膜容受性得以重建，从而有利于胚胎着床，提高EMS患者的临床妊娠率，为EMS患者不孕的治疗提供了新的方向。