正交试验优选白花延龄草中重楼皂苷Ⅶ提取工艺研究

李小沛，张亚玉，赵立春，张春阁，刘继永

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

延龄草为百合科延龄草属植物，全世界约有50种，我国有3种，即延龄草（Trillium tschonoskii Maxim.）、白花延龄草（T.kamtschaticum Pall.）和西藏延龄草（T.govanianum Wall.）[1-2]。延龄草生于海拔 1 600～3 200 m的林下、山谷阴湿处、山坡或路旁岩石下，主产于我国西北、东北和西南地区[3]，为珍稀濒危物种。目前，主要采取迁地保护、建立自然保护区、恢复和保护延龄草生长的生态环境、组织培养、遗传多样性研究等手段加以保护[4-8]。

延龄草为国家医药管理局管理的二类药材，其化学成分以皂苷类为主，具有丰富的药理活性，重楼皂苷为其中一种。重楼皂苷具有抗肿瘤、抗菌、止血、消炎、镇静、镇痛、抗氧化、免疫调节、抑制血管生成、保护肝脏与肾脏等功效，广泛应用于各类疾病的治疗，是宫血宁、云南白药等中成药的主要成分之一[9-10]。目前，有关白花延龄草中重楼皂苷Ⅶ提取工艺研究相对较少，本试验采用正交试验对白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的提取工艺进行优化。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Acquity UPLCH-Class（美国Waters公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水器（美国 Millipore公司）；XS205电子天平（瑞士Mettler toledo公司）。

1.2 材料

白花延龄草根茎采自中国农业科学院特产研究所吉林省左家白花延龄草驯化栽培实验田，由中国农业科学院特产研究所刘继永研究员鉴定。

重楼皂苷Ⅶ（纯度≥98%，农业部特种动植物产品质量安全风险评估实验室）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；无水甲醇、正丁醇（分析纯，北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 重楼皂苷Ⅶ含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：WatersBEHC1（8 2.1mm 50 mm，1.7m）；检测器：PDA；流速：0.4 mL/min；柱温：35℃；检测波长：203 nm；进样量：1L；流动相：乙腈-水，线性梯度洗脱（表1）。在此色谱条件下，重楼皂苷Ⅶ对照品（A）及白花延龄草样品（B）HPLC色谱图见图1。

表1 流动相体积比例Table 1 Mobilephase ratio

图1 重楼皂苷Ⅶ对照品（A）和白花延龄草样品（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLCchromatogram of polyphyllinⅦstandard(A)and T.kamtschaticum Pall.samples（B)

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取1.08mg重楼皂苷Ⅶ对照品粉末，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，配制成0.108 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取白花延龄草根茎适量，于75℃烘箱烘至完全干燥[11]，粉碎，过60目筛。精密称取样品粉末2 g，共9份，置于250 mL圆底烧瓶中，按照料液比1∶7加入适量甲醇，浸泡过液，70℃回流提取4 h，过滤，将溶液蒸干，加适量水溶解，各加入50 mL水饱和正丁醇[12]萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，0.22m微孔滤膜过滤，备用。

2.1.4 线性关系 精密吸取对照品溶液，加甲醇配制成 20.040、10.020、4.536、2.024、1.012g/mL的溶液进样，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到重楼皂苷Ⅶ标准曲线回归方程：Y=2 877.8X+404.76，R2=0.999 8（n=5），对应的峰面积分别为 57 967、29 572、13 125、6 483、3 174（图2）。

图2 重楼皂苷Ⅶ标准曲线Fig.2 Standard curve of polyphyllinⅦ

2.1.5 精密度 按照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法制备样品，并按照“2.1.1”项下色谱条件重复进样5次，分别记录峰面积，并计算其峰面积RSD为0.31%，说明仪器精密度良好（表2）。

表2 精密度试验Table 2 Precision experiment

2.1.6 重复性 精密称取白花延龄草根茎粉末2.0 g，按照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积，代入重楼皂苷Ⅶ标准曲线的回归方程，计算得到白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的平均含量为 0.337 mg/g，RSD为0.68%。说明该方法重复性良好（表3）。

表3 重复性试验Table 3 Repeated experiment

2.1.7 稳定性 精密称取白花延龄草根茎粉末2.0 g，按照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件每隔4 h进1次样，结果显示，峰面积RSD为0.48%。说明样品在16 h内性质稳定（表4）。

表4 稳定性试验Table 4 Stability experiment

2.1.8 加样回收率 精密称取9份已知含量的白花延龄草根茎粉末，分别加入重楼皂苷Ⅶ对照品溶液适量（浓度为0.108mg/mL），按照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法，分别制备9份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积，计算得到白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的平均回收率为98.2%，RSD=0.83%（表5）。

表5 加样回收率试验Table 5 Recoveries of polyphyllinⅦin samples

2.2 提取工艺优化

对白花延龄草药材粉末采用回流法提取[13]，选用料液比、提取时间、提取温度3个考察因素，每个因素选取3个水平，用L9（34）正交表进行试验设计（表6）。正交试验结果见表7，方差分析结果见表8。

表6 正交试验因素水平Table 6 Levels and factorsof orthogonal experiment

表7 正交试验结果Table 7 Results of orthogonal experimental

表8 方差分析结果Table 8 Analysis of variance

由表7和表8可知，C因素是影响重楼皂苷Ⅶ提取含量的主要因素，即提取温度。其次是料液比，提取时间在4h以上对重楼皂苷Ⅶ含量影响不大。白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的最佳提取工艺条件为A3B1C3。

2.3 验证试验

为验证此最佳工艺条件的稳定性，精密称取白花延龄草根茎粉末2.0g按照料液比1∶9、提取时间4h、提取温度90℃，平行制备3份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积，代入重楼皂苷Ⅶ标准曲线的回归方程，对优化工艺进行验证。计算得到白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的平均含量为0.930 mg/g，RSD 为 0.91%（表9）。

表9 工艺验证试验Table 9 Results of validation experiment

3 结论与讨论

目前的研究多采用超声法提取重楼皂苷，该试验采用回流法进行提取，并考虑多种因素，通过正交试验对白花延龄草重楼皂苷Ⅶ的提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件为A3B1C3，即料液比1∶9、提取时间4h、提取温度90℃。在此工艺条件下，白花延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ的含量为0.931 mg/g。

回流法提取工艺重复性良好、稳定性强，可用于各种中草药中受热不易遭受破坏的有效成分的提取研究，尤其是皂苷类成分。在最佳提取工艺条件下，进行不同加工工艺的研究，更能有效增加各种成分提取率。