超高效液相色谱检测白酒中纽甜含量的方法确认和应用

白丽真，刘 伟，刘洪银

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

纽甜，是一种新型的功能性非营养型甜味剂，甜度极高，易溶于水，是阿斯巴甜的衍生物。因其在安全性、稳定性、经济性等各方面突出的表现，被广泛使用[1-4]。2002年美国FDA审核通过允许纽甜作为食品添加物应用在所有食品及饮料。欧盟于2010年正式批准其应用，其指定代码为E961。中华人民共和国卫生部2003年第4号公告也正式批准纽甜为新的食品添加剂品种，适用各类食品生产[5]。但是国标强制性标准GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定，白酒中不得添加甜味剂[6]。

GB 5009.247—2016《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》[7]中规定食品中纽甜的测定方法为高效液相色谱法，样品需经混合提取液提取，固相萃取柱净化后，方可进样，过程较复杂，影响因素很多。本实验在国标方法的基础上，简化前处理过程，无需过萃取柱，去酒精后定容直接进样，操作简单，进样时间短，经超高效液相色谱检测，结果准确，灵敏度高，检出限低，经济有效，该方法可用于对白酒中纽甜含量的测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：均为市售的不同香型白酒样品，共4个。

试剂及耗材：乙腈（LC/MS级，Fisher）；实验用水为Milli-Q超纯水；纽甜（含量98%，北京百灵威科技有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；1-辛烷磺酸钠盐（HPLC级，Alfa aeser）。

仪器设备：超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC®，美国Waters公司)，配二极管阵列检测器；Milli-Q Reference超纯水发生器(美国Millipore公司)；电热板（广州格丹纳仪器有限公司）；0.22 μm有机滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 实验方法

离子对试剂缓冲液：称取2.00 g辛烷磺酸钠用水溶解，加入1.0 mL磷酸，用超纯水定容至1000 mL，过膜。

1000 mg/L纽甜储备液：准确称取0.1 g纽甜至100 mL容量瓶，用超纯水溶解并定容到100 mL，置于4℃冰箱中保存待用。根据使用需要用超纯水逐级稀释成适当浓度的标准工作液。

样品前处理：准确量取10 mL酒样于50 mL玻璃烧杯，置于电热板上，120℃蒸发去酒精处理90 min，将剩余的样品用超纯水定容至10 mL，过0.22 μm有机滤膜，待上机分析。

1.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)；柱温：30 ℃；样品室温度：20 ℃；进样体积：2 μL；流动相：A相为乙腈，B相为离子对试剂缓冲液；流速：0.4 mL/min；检测波长：218 nm；梯度洗脱程序见表1。

表1 纽甜的梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

国标中前处理的方法比较繁琐，耗用的试剂材料比较多，且耗时较长，因此本研究中寻求一种简单快捷的前处理方法。由于白酒样品中含有乙醇，直接进样容易造成溶剂效应，因此本实验先挥发掉乙醇，再用超纯水定容至原体积。图1是直接进样和挥发酒精后进样两种方法的比较。

图1 两种前处理方式比较示意图

从图1可以看出，酒样加入2 mg/L的标准品后直接进样后得到的色谱图，非目标峰比较多，且峰面积较大，尤其是在靠近目标峰时有一个较大的峰，保留时间稍有偏移，就会造成目标峰识别错误，从而引起假阳性的错误。或者造成目标物含量变化，定量结果不准确，一般情况下是含量增加。图1中挥发进样谱图是将10 mL样品加标对应浓度后再在120℃电热板上将样品蒸发至剩余约1 mL，然后定容至10 mL后在相同条件下进样分析得到的色谱图。相对于直接进样来说，挥发酒精后色谱图比较干净，目标峰前后的干扰峰较少，从而提高了目标峰识别的正确率，保证了定量的稳定性。

通过两种前处理方式得到的色谱图的比较，最后选择挥发酒精后再进样的前处理方式。去酒精处理后进样色谱图见图2。

2.2 液相条件的优化

本实验用国标方法中的流动相，将流动相梯度洗脱程序进行转换和调整，找到了适合超高效液相色谱仪的梯度洗脱程序，见表1，进样时间为4 min。

2.3 线性范围和检出限

用1000mg/L的纽甜储备液分别稀释至0.1mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L，进样，做标准曲线，如图3，标线曲线R2为0.9999。以信噪比（S/N）为3确定检出限（LOD），纽甜的检出限为0.03 mg/L。

2.4 精密度和回收率

本实验对4个市售的不同香型白酒样品进行前处理进样检测，结果均为未检出。选取某市售酒样（编号Y1）作为加标回收的样品。选取标准曲线浓度范围内高浓度2 mg/L和低浓度0.5 mg/L做加标回收（标准曲线浓度范围0.1～5 mg/L）。结果见表2。由表2可看出，样品高浓度和低浓度的回收率均在95%～105%之间，符合回收率的测定要求，RSD值小于2%。

2.5 与国标方法比较（表3）

如表3所示，本文的方法与GB 5009.247—2016《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》标准中规定食品中纽甜的测定方法相比，本文建立的方法有前处理简单，进样时间短，大大减少了有机溶剂的消耗，经济节约，方法准确，灵敏度高，检出限低等优点。

图2 纽甜的色谱图（5 mg/L）

图3 纽甜标准曲线图

表2 样品回收率数据

表3 两种方法比较

3 结论

本试验在GB 5009.247—2016《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》的基础上，简化了纽甜检测的前处理方法，优化了液相条件，将其用于对白酒中纽甜含量的检测。该方法简单快速，进样时间为4 min，经济节约，与国标方法相比，该方法灵敏度高，准确性好，检出限低，同时，该方法的回收率和精密度均可满足国标要求，为白酒生产企业对白酒中纽甜含量的监督提供了有力的技术支持。