MALAT1通过竞争miR-124上调SMYD3并促进乳腺癌细胞增殖与迁移

徐曼丽,王 畅,王 楠,何红鹏,张同存，罗学刚

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物学教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

乳腺癌是严重威胁女性生存的重大疾病，据2018年美国肿瘤学会发表的GlobalCancerStatistics2018报道，在860万女性肿瘤中，乳腺癌的新发率占到了24.2%，死亡率占15.0%，均高居第一位[1]。组蛋白甲基转移酶SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)可以特异性使H3K4、H4K5、H4K20发生组蛋白甲基化[2]，并可作为转录因子调控基因转录表达、参与信号转导过程，其过表达在包括乳腺癌在内的多种肿瘤[2-4]中具有关键的作用，此外，研究发现SMYD3很可能对心血管系统也有着重要的作用[5-6]。然而，目前对于SMYD3的功能及调控机制还并不十分清楚。

非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是不编码蛋白质的RNA。人们曾认为ncRNA不具有具体生理功能，然而随着研究的深入，人们逐渐发现ncRNA在基因转录表达调控中发挥着十分重要的作用。其中，微小RNA(micro RNA,miRNA)是目前被研究的最多的一类ncRNA，其最为常见的作用机制是通过与目标mRNA的3′非翻译区(3′UTR)结合来调节基因的表达，导致目标mRNA降解，蛋白质的翻译受到抑制。目前已经发现：miR-124可通过直接靶向SMYD3 mRNA的3′UTR，在转录后水平抑制SMYD3的表达[7]。

此外，另一类倍受研究者关注的ncRNA是长度为200～1 000个核苷酸的长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)[8]。lncRNA MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)又称为NEAT2(nuclera-enriched autosomal transcript2)，属于lncRNA家族重要成员，其不仅在血管生成过程中[9]发挥着重要作用，而且在肿瘤中也有十分重要关系。MALAT1在乳腺癌[10-11]、肝癌[12-13]、胃癌[14-15]、舌鳞癌[16]等恶性肿瘤中均呈现出异常的高表达，促进肿瘤细胞的迁移和增殖[17]，影响肿瘤细胞耐药[18]且与多种实体肿瘤的不良预后相关[19-20]。然而，尽管MALAT1和SMYD3都与肿瘤的发生发展相关，但二者间是否存在内在的调控关系，迄今尚属未知。鉴于此，本课题组将对此展开分析研究。

1 材 料

1.1 试 剂

胎牛血清(天津康源生物技术有限公司)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；siRNA和miRNA mimics/inhibitor(中国Ribobio公司)；SMYD3一抗(英国Abcam公司)；GAPDH一抗(中国优抗公司)；荧光二抗(美国Li-coR公司)；Trizol试剂、M-MLV逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；SYBR GREEN染料(德国DBI公司)；青霉素、链霉素、胰酶、MTT及RNase A(北京索莱宝科技有限公司)。pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3质粒由美国OSI制药公司Kenneth W.Foreman博士馈赠。PGL3-MALAT1-promoter质粒由台湾国立成功大学的Yi-Ching Wang教授馈赠。PGL3-SMYD3启动子质粒由本实验室自己构建。

1.2 仪 器

ABI-Step OneTM型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Odyssey红外激光成像系统(美国Li-coR Biosciences公司)。

1.3 细 胞

人胃癌细胞系MGC-803，人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和T47D均购自上海中科院，并在本实验室长期保存。

2 方 法

2.1 细胞培养

人胃癌细胞系MGC-803，使用DMEM培养基；人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和T47D细胞使用RPMI-1640培养基，培养基中均加入10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素，在饱和水蒸气、5% CO2恒温培养箱中进行37 ℃贴壁培养。待细胞汇合度达到70%～90%时，采用0.25%胰酶温和消化传代。

2.2 细胞转染

设计特异性干扰SMYD3的siRNA靶序列分别为：SMYD3-1，5′-AACATCTACCAGCTGAAGGTG-3′；SMYD3-2，5′-CAAGGATGCTGATATGCTA-3′；SMYD3-3，5′-GGAAGTTGGTGTTGGCCTA-3′。干扰MALAT1使用的是3个位点混合的siRNA，分别是：5′-GCCCGAGACTTCTGTAAAG-3′；5′-GCAGCCCGAGACTTCTGTA-3′；5′-GGGCTTCTCTTAACATTTA-3′。用高纯度质粒提取试剂盒提取质粒：pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3、PGL3-MALAT1-promoter以及PGL3-SMYD3启动子质粒。将胰蛋白酶消化的细胞接种于6孔培养板；次日，将孔板中换为无血清的基础培养基，用脂质体Turbofect进行对siRNA；pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3、PGL3-MALAT1-promoter以及PGL3-SMYD3启动子质粒；micro RNA mimics或micro RNA inhibitor进行转染，将待转的质粒或siRNA和脂质体按比例预混于无血清基础培养基中，静置20 min，将混合液转移至待转染的孔板中，并补充无血清的基础培养基至2 mL，置于培养箱中培养6 h，然后换成RPMI-1640完全培养基，继续培养。

2.3 MTT法

在96孔板中接种细胞，转染后置于CO2培养箱培养，并分别在相应时间，向每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，避光37 ℃反应4 h后随即弃去培养基，加入DMSO 150 μL溶解甲攒结晶。在酶标仪中检测490 nm波长下的吸收度。

2.4 实时荧光PCR(Real-time RCR)

处理过的细胞培养24 h后，加入Trizol 1 mL，4 ℃ 下裂解提取RNA。取总RNA 2 μg加入M-MLV及随机引物，进行逆转录得到cDNA，随后即可进行PCR。PCR所用到的引物序列为：GAPDH，上游5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；SMYD3，上游5′-CCCAGTATCTCTTTGCTCAATCAC-3′，下游5′-ACTTCCAGTGTGCCTTCAGTTC-3′；MALAT1,上游5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下游5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；MYL9，上游5′-CACCCACCAGAAGCCAAGAT-3′，下游5′-TGCCCTCCAGGTATTCGTCT-3′；MMP9，上游5′-GAGCACGGAGACGGGTAT-3′，下游5′-GGACCACAACTCGTCATCG-3′；CYR61，上游5′-AGCAGCGTTTCCCTTCTAC-3′，下游5′-TGAGTCCCATCACCCACA-3′。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环，并以ΔΔCt法对结果进行计算。

2.5 免疫蛋白印迹法(Western blot)

细胞转染48 h后，用预冷的PBS冲洗细胞2～3次，加入蛋白裂解液后4 ℃裂解30 min。细胞刮刀刮下皿底的细胞，收集于1.5 mL的EP管中。取蛋白裂解液40 μL加入上样缓冲液8 μL，漩涡振荡后置于100 ℃沸水中10 min，离心备用。上样，蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。将转好的硝酸纤维素膜置于封闭液中，室温下振荡2 h，然后用相应的一抗SMYD3(兔抗人单克隆抗体；稀释度，1∶1 000)、GAPDH(小鼠抗人；稀释度，1∶5 000)封闭过夜。随后，将一抗弃去，PBS冲洗3次后，加入荧光二抗：山羊抗兔抗体和山羊抗鼠抗体，孵育2 h后，PBS清洗3次后，使用Odyssey扫膜仪进行扫膜。

2.6 荧光素酶活性检测(luciferase reporter assay)

细胞接种于24孔板中，然后置于培养箱培养24 h后，预冷PBS清洗2～3次，每孔加入蛋白裂解液100 μL，置于冰上裂解30 min，随后刮取细胞，取蛋白裂解液5 μL于考马斯亮蓝G-250 200 μL的透明孔板中，置于酶标仪于595 nm检测蛋白质含量，在白板中加入蛋白裂解液50 μL，以及荧光底物，同样置于酶标仪进行检测。

2.7 数据与统计

所有实验结果均至少重复3次，数据由Graphpad Prism 5.0进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 敲低MALAT1会抑制乳腺癌细胞增殖和迁移

为了探讨MALAT1是否参与乳腺癌细胞的增殖与迁移，利用siRNA技术抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞中MALAT1内源性的表达，然后分别应用MTT法及划痕愈合实验于不同时间检测细胞增殖和迁移情况。结果如图1所示：相对于si-control转染组，转染si-MALAT1的细胞划痕愈合速度(图1-A)更加缓慢，同样的，在MCF-7细胞中，相对于si-control转染组，转染si-MALAT1的细胞增殖速度也更加缓慢(图1-B)。

After transfection with MALAT1-specific siRNAs (si-MALATI),the migration ability of cells was detected by a wound healing assay (A),and proliferation capacity was analyzed by MTT (B)

3.2 敲低MALAT1会抑制SMYD3及其下游相关基因的表达

为了探究MALAT1与SMYD3在乳腺癌细胞中转录表达水平的相关性，利用特异性siRNA敲低MALAT1的转录表达，然后应用实时定量PCR、Western blot的方法对MALAT1、SMYD3及其下游基因的转录表达水平进行了检测。siRNA特异性靶向敲除MALAT1的效率，如图2-A所示，siRNA成功干扰MALAT1的表达；由图2-B和2-C可以看出，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，RNAi抑制内源性MALAT1可使SMYD3的mRNA和蛋白质水平明显下调；在人胃癌细胞系MGC-803以及人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、T47D检测SMYD3 mRNA的表达，由图2-D所示，在MCF-7、MDA-231和T47D细胞等不同的人乳腺癌细胞系中，SMYD3均显著高表达。除此以外，进一步应用荧光素酶报告分析方法检测了在MCF-7细胞中，MALAT1的干扰对SMYD3启动子的影响，结果显示：siRNA特异性干扰MALAT1后，可以使SMYD3启动子驱动下荧光素酶活性呈现出一定程度的下调(图2-E)，这表明MALAT1可直接对SMYD3的启动子产生一定的转录激活作用，但较为微弱。同时实验结果也显示：在siRNA干扰MALAT1后，MYL9、MMP9、CYR61、N-cadherin等受到SMYD3调控的下游基因的转录表达也均呈现出了显著的下降[4,21-22]。这些结果表明SMYD3的转录表达会受到MALAT1的调控，其中涉及到对启动子的直接转录调控作用，但很可能同时还存在其他作用机制。

3.3 MALAT1作为miR-124的ceRNA调控SMYD3的表达

为了进一步了解MALAT1对SMYD3的调控分子机制，使用生物信息学软件starbase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)对与MALAT1存在结合位点的miRNAs进行了分析预测。结果显示：可靶向SMYD3 3′UTR对SMYD3产生负调控作用的miR-124同时也可以靶向与MALAT1结合，提示彼此间可能会存在竞争性关系(图3-A)。进一步的Real-time PCR分析发现：在MCF-7细胞中应用siRNA靶向干扰MALAT1后可使miR-124的含量增加(图3-B)，转染miR-124模拟物可使SMYD3受到抑制，反之miR-124抑制剂则使SMYD3的表达显著升高(图3-C和3-D)，而将MALAT1的siRNA和miR-124 inhibitor在MCF-7细胞中进行共转染后，免疫蛋白印迹检测显示在MCF-7细胞中RNAi下调MALAT1可以明显缓解miR-124抑制剂对SMYD3表达的促进作用(图3-E)。这些结果表明MALAT1可通过与SMYD3竞争miR-124的结合，从而间接调控了SMYD3的表达水平，即MALAT1可以作为miR-124的“海绵(sponge)”，以ceRNA 的形式对SMYD3表达进行调控。

A:Interference efficiency of MALAT1 was detected by Real-time PCR;B,C:Protein and mRNA expression of SMYD3 were detected by Western blot and Real-time PCR;D:mRNA level of SMYD3 in breast cancer cell lines compared with gastric cancer cell MGC-803 were analyzed by Real-time PCR;E:Effect of MALAT1 interference on the luciferase activity of SMYD3-promoter reporter was detected by luciferase assay in MCF-7 cells;F:mRNA levels of MYL9,MMP9,CYR61 and N-cadherin were determined by Real-time PCR

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

A:Binding sites of miR-124/MALAT1 and SMYD3 3′UTR;B:After transfection with MALAT1-specific siRNAs,the miR-124 mRNA expression of MCF-7 ells was detected by Real-time PCR;C,D:After transfection with miR-124 mimics/inhibitor,SMYD3 expression of MCF-7 ells was detected by Western blot;E:After co-transfection of miR-124 inhibitor and MALAT1 siRNA,the protein expression level of SMYD3 was detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.4 SMYD3表达可反馈激活MALAT1转录

很多研究发现，在lncRNA调节基因转录中，时常也同时存在着靶基因对lncRNA的反馈式调节作用[23]。因此，本研究进一步探讨了SMYD3是否也会影响MCF-7细胞中MALAT1的表达。首先，如图4-A和4-B，SMYD3的siRNA可以成功干扰SMYD3的表达。实时定量PCR和免疫蛋白印迹分析结果显示：相对于对照组，转染特异性siRNA干扰SMYD3后会抑制MALAT1的转录水平(图4-C)，反之，瞬时转染SMYD3的过表达质粒则会引起MALAT1的显著上调(图4-D)。进而，为了确定SMYD3对MALAT1启动子转录活性是否存在影响，进行了启动子荧光素酶报告基因活性检测，结果显示SMYD3的过表达可以剂量依赖性的促进MALAT1的启动子活性(图4-E)。

A,B:Interference efficiency of SMYD3 was detected by Real-time PCR;C,D:Effect SMYD3 overexpression and knockdown on MALAT1 mRNA level;E:Effect of SMYD3 overexpression on the luciferase activity of MALAT1-promoter reporter was detected by luciferase assay in MCF-7 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

4 讨 论

表观遗传是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。其中包括DNA修饰、ncRNA调控、组蛋白修饰等。目前发现，不同的表观遗传修饰之间存在着错综复杂的彼此调控关系。其中非编码RNA调控是通过某些机制实现对基因转录的调控，例如miRNA可以通过结合靶基因mRNA导致基因沉默，而lncRNA可以通过竞争性地结合microRNA，以ceRNA的形式来调节靶基因表达[24-25]。

lncRNA MALAT1广泛表达于哺乳动物正常组织，并在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中异常表达，虽然MALAT1不直接编码蛋白，但其对肿瘤的增殖、凋亡、侵袭转移以及耐药等都有不同程度的影响，发挥重要作用。如，MALAT1的内源性缺失可以抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移[26]。hsa-miR-125b可以通过下调MALAT1的表达而抑制膀胱癌的发展[27]。MALAT1作为miR-106b-5p的ceRNA通过SLAIN2增强微管移动性促进结直肠癌的侵袭和转移[17]。在口腔鳞癌中，MALAT1可能通过调控EMT促进的增殖和侵袭过程[28]。在三阴性乳腺癌中MALAT1通过靶向miR-129-5p促进增殖和侵袭。异常表达的KDM5B通过MALAT1过表达和下调hsa-miR-448来促进侵袭性乳腺癌[29]。MALAT1通过竞争性结合miR-1调节cdc42表达来诱导人乳腺癌细胞的迁移和侵袭[30]。在本研究中显示RNAi抑制MALAT1后使乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231增殖和迁移能力的受到抑制，同时研究中也发现siRNA靶向干扰MALAT1后使SMYD3的mRNA和蛋白质水平也受到了抑制，且值得注意的是，MALAT1与SMYD3之间的调控关系未见报道。

SMYD3已被证实在乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤癌组织中都有异常的高表达，而在相应的正常组织中表达量低[2]，这与肿瘤患者的存活率密切相关[3]。并且本课题组研究发现[32-33]，干扰SMYD3可抑制宫颈癌细胞的增殖与迁移；SMYD3的过表达可上调迁移基因MYL9，与MRTF-A协同促进乳腺癌发生迁移[4]。SMYD3通过金属蛋白酶MMP9的表观遗传上调促进肿瘤侵袭[21]。miR-200c可能是乳腺癌细胞迁移过程中SMYD3介导通路的下游负调控因子[34]。除此以外，SMYD3可以促进乳腺癌的上皮细胞间质转化(EMT)[22]。由此可见，SMYD3已被视为是非常有潜力的肿瘤基因治疗及药物研发新靶点之一。在本研究中也发现，MALAT1 siRNA特异性干扰MALAT1后，使受SMYD3调控的下游相关基因(如:EMT标志基因N-cadherin、迁移基因MYL9、金属蛋白酶MMP9等)的表达也发生了下调。

研究表明，miR-124可通过下调肝内胆管癌细胞中SMYD3的表达来抑制迁移和侵袭[7]。在本研究中发现，在乳腺癌细胞中RNAi抑制MALAT1后促进了miR-124基因水平的表达，miR-124也会影响SMYD3的表达，且miR-124抑制剂对SMYD3的促进作用可因MALAT1的抑制而减弱，说明MALAT1可能介导其中，除此以外，本研究也发现SMYD3可反馈激活MALAT1转录，这提示SMYD3、MALAT1、miR-124三者之间很可能会通过这种反馈式的恶性循环调节方式，加剧乳腺癌的发展进程。本研究为乳腺癌的防治提供了一些新的思路。