密度梯度离心法联合上游法处理精液对精子功能的影响

杨乙　刘秀菊　张丽珍　李晓红　邹华华　温泰芳

【摘要】 目的 分析密度梯度離心法联合上游法处理精液对精子功能的影响。方法 200份精液标本作为研究材料， 根据材料编号不同随机分为对照组与实验组， 各100份。对照组使用密度梯度离心法进行精液处理检测， 实验组使用密度梯度离心法联合上游法进行精液处理检测， 比较两种检测方法对精子功能的影响。结果 实验组样本存活率、活力以及形态均显著优于对照组， 精子DNA碎片率明显低于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组样本精子DNA碎片指数（DFI）、高可染性精子指数（HDS）水平分别为（22.57±4.46）%、（13.89±2.24）%， 均明显优于对照组的（13.21±3.18）%、（8.12±2.59）%， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 密度梯度离心法联合上游法具有较好的精液处理能力， 有利于提高精子的存活率， 且不会造成精子DNA损伤， 在精液处理中发挥出了较好的应用及推广价值。

【关键词】 密度梯度离心法;上游法;精子功能;存活率

密度梯度离心法和上游法是目前较为常见的精液处理方式， 随着两种处理方式在人工授精领域中的广泛应用， 针对二者精液处理效果的研究也日益增多。有报道指出， 通过对二者的有效联合， 将为提高精液处理能力产生积极的影 响[1， 2]。基于此， 本研究针对200份精液标本进行了不同处理方式的效果对比分析， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 选择2017年2月～2018年8月送检于本科生殖实验室的200份精液标本作为研究材料， 根据材料编号不同将其随机分为对照组与实验组， 各100份。所有精液标本均于研究对象空腹状态下进行采集， 且在采集过程中严格遵循无菌操作流程。

1. 2 方法 对照组采用密度梯度离心法。实验组采用密度梯度离心法联合上游法。密度梯度离心法操作方法：①取浓度为80%和40%的密度梯度分离液（SAGE美国）各2 ml， 上层加入2.0 ml的液化精液， 此时必须注意保持各液体之间的界面清晰;②300 g离心20 min， 去上清液;③加入2 ml培养液[拟人输卵管液（mHTF） +10%血清替代物（SPS）]充分混匀， 200 g离心5 min， 取上清， 并将沉淀团混匀;④沿管壁倾斜加入适量洗精液， 松盖， 并倾斜45°放置于温度为37℃的CO2培育箱内， 上游1 h;⑤上游结束后， 记录精子悬液数量。上游法操作方法：将液化后的精液混匀后， 将1 ml的精液加入至5 ml试管底部， 并于其上方加入2 ml的人类输卵管液（HTF液）， 确保离心管倾斜角度为45°后， 将其放置于37℃的培养箱内， 培养上游30～60 min， 在此过程中避免晃动。培养后， 使用吸管将上层的雨雾状液体吸出， 并转移至另一个试管内， 同时添加2 ml的HTF液， 混匀， 使用离心机离心5 min， 转速为1100 r/min。最后吸出上清液， 加入0.5 ml的HTF液， 沉淀松散后分层加入HTF液， 共计加入1 ml， 45°倾斜后放置于培养箱内培养20 min， 最后吸取上部的精子 悬液。

1. 3 观察指标 比较两组样本的存活率、活力、形态、精子DNA碎片率、DFI、HDS水平。利用精子染色质结构分析试验（SCSA）检测精子功能， 根据计算机辅助精液分析（CASA）结果中的精子浓度， 使用4℃ TEN将样本稀释成（1～2）×10/ml 的精子悬液， 放置于4℃的环境下待测， 同时对流式细胞仪（美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪）的激发光波长和二色滤光片进行调整， 激发光波长为488 nm， 在峰顶或峰高处收集红色荧光（≥630 nm）和绿色荧光（515～530 nm）， 使用AO平衡缓冲液对流式细胞仪的样品通道进行平衡， 取50 μl稀释精子悬液放置于样管中， 加入100 μl的酸处理液（pH值为1.2）后， 立即开启秒表计时旋涡混合30 s后加入300 μl的染色液染色， 并低速流动样品2 min。所有样品的获取和储存均使用专门的软件， 并计算出样本的SCSA参数， 包括DFI和HDS。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 两组样本存活率、活力、形态、精子DNA碎片率比较 实验组样本存活率、活力以及形态均显著优于对照组， 精子DNA碎片率明显低于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 两组样本DFI、HDS水平比较 实验组样本DFI、HDS水平分别为（22.57±4.46）%、（13.89±2.24）%， 均明显优于对照组的（13.21±3.18）%、（8.12±2.59）%， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

密度梯度离心法主要是指将精液放置于不同密度的介质， 利用不同成熟阶段精子以及细胞成分之间存在的密度差异的一种精液处理方式[3， 4]。上游法是在精液上加上一种密度较低的介质， 通过精子的向上游动实现对精液的处理和分离。实践经验表明， 不同精液处理方式的处理效果不同[5-7]。

本研究结果显示， 实验组样本存活率、活力以及形态均显著优于对照组， 精子DNA碎片率明显低于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）;实验组样本DFI、HDS水平分别为（22.57±4.46）%、（13.89±2.24）%， 均明显优于对照组的（13.21±3.18）%、（8.12±2.59）%， 差异具有统计学意义（P<0.05）。说明相较于单独使用密度梯度离心法， 密度梯度离心法联合上游法对于精子存活率水平的提升产生了积极影响， 且不会影响精子DNA的完整性。

综上所述， 密度梯度离心法联合上游法具有较好的精液处理能力， 且对于精子功能的影响相对较少， 有利于提高精子的存活率， 在精液处理中发挥出了较好的应用及推广价值。

参考文献

[1] 黄悦悦， 毛献宝， 薛林涛， 等. 上游法与密度梯度离心法处理对于精子顶体完整性、DNA损伤产生的影响分析. 中国保健营养， 2017， 27（6）：32.

[2] 何玮， 郑洁， 李俊林， 等. 密度梯度离心法与直接上游法在宫腔内人工授精中的应用效果分析. 西南军医， 2012， 14（1）：10-12.

[3] 吴斌， 许文太， 周洪贵. 密度梯度离心法结合上游法优化精液对体外受精-胚胎移植临床结局的影响. 现代医药卫生， 2018， 38（5）：687-689.

[4] 陈钢鑫， 康跃凡， 林典梁， 等. 密度梯度离心法对不同质量精液的影响. 海峡预防医学杂志， 2017， 23（2）：55-57.

[5] 欧展辉， 陈志恒， 王慧， 等. 不同的精液处理方法对体外受精IVF周期结局的影响. 中国优生与遗传杂志， 2017， 27（10）：120-121.

[6] 王喜良， 崔鑫， 郑春杨， 等. 密度梯度离心法联合上游法制备精子除菌效率观察. 解放军医药杂志， 2014（5）：65-67.

[7] 刘容菊， 李志凌. 精液密度梯度离心联合上游法优选的意义. 国际医药卫生导报， 2014， 20（9）：1221-1224.

[收稿日期：2018-12-06]