利用TCGA数据库分析识别胃癌预后相关的特异性miRNA

吴逍风　李奉喜　黄道来　李贵彬　庞森　陈俊　黄精乐

【摘要】 目的 探讨特异性miRNA与胃癌预后相关性。方法 从TCGA数据库下载203例胃癌及24个癌旁组织miRNA和mRNA表达谱数据及相应的临床资料。应用 “edgeR”R包分别对比分析癌与癌旁样本miRNAs及mRNA差异性。结合生存资料， 采用KM曲线法进行差异miRNAs及靶基因生存分析。针对筛选出的靶基因进行KEGG信号通路富集分析及GO功能注释。结果 miRNA生存分析结果表明， miR-17， miR-139， miR-323b， miR-365a， miR-551b， miR-7705， miR-877和miR-944与胃癌患者生存时间密切相关。KEGG通路和GO功能分析结果表明， 靶基因主要富集在“pathways in cancer”“MicroRNAs in cancer”， “MAPK signaling pathway”， “cell cycle”以及“apoptosis”等肿瘤相关通路。结论 筛选出关键miRNA及其靶mRNA与胃癌发生、预后密切相关， 可作为新的潜在的治疗靶点和检测预后的生物标志物。

【关键词】 胃癌;miRNA;预后;生物标志物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.09.019

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一， 2012年WHO资料统计全球每年胃癌新发病例超过95万例， 每年因胃癌死亡的人数超过72万人， 病死率占恶性肿瘤的第三位[1]。

2015年我国癌症登记中心资料显示， 胃癌发病率与死亡率逐年升高， 仅次于肺癌[2]。近年来， 随着胃癌早期诊断及治疗的迅速发展， 早期胃癌的5年死亡率显著下降， 而晚期胃癌的的5年死亡率仍高达30%～50%[3]。因此， 寻找胃癌诊断、治疗及预后相关的新的潜在生物标志物成为研究热点。研究表明， miRNA可调控靶基因表达， 参与信号通路， 影响肿瘤发生发展， 发挥致癌或抑癌作用[4]。本研究从TCGA数据库下载胃癌及其癌旁样本RNA芯片数据， 探寻胃癌关键miRNA及其靶基因， 为胃癌诊治、预后提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 从TCGA数据库下载胃癌及癌旁样本miRNA及mRNA芯片数据， 同一样本中只有mRNA或miRNA芯片数据的样本不纳入研究， 最终共纳入203例胃癌样本及24例癌旁样本芯片资料。203例样本均经病理诊断确诊为胃癌。

1. 2 胃癌miRNA及mRNA差异表达分析 收集样本的RNA表达谱数据， 调用R语言edgeR包对比分析胃癌与癌旁组织RNA表达差异性， 筛选出差异倍数（fold change， FC）>2倍且P<0.05的差异表达RNA。

1. 3 生存分析 结合胃癌患者RNAs表达谱数据及生存资料， 采用 KM曲线法绘制生存曲线， 分析miRNA及其靶基因与胃癌患者预后相关性， P<0.05表示差异有统计学意义。

1. 4 胃癌miRNA靶基因筛选及其功能分析 基于筛选出的关键miRNA， 应用miRNA靶基因预测数据库（miRDB、miRTarBase和TargetScan）筛选靶mRNA。为增加靶mRNA的可信度， 同时检索3个miRNA靶基因预测数据库， 靶mRNA需满足以下条件：应同时包含于3个数据库中;并且是胃癌差异表达mRNA。采用KOBAS 3.0进行靶基因KEGG信號通路富集及GO功能注释分析。

2 结果

2. 1 胃癌患者临床病理资料特征 胃癌患者平均年龄66岁， ≥66岁110例;<66岁93例。男性患者较女性多， 男女性别比约为1.57∶1。其中G3期患者占62.1%。

2. 2 胃癌特异性miRNA和mRNA差异分析 采用R包edgeR对比分析胃癌与癌旁样本RNA表达差异， 满足FC>2且 FDR<0.01的差异miRNAs 181个， 其中上调的147个， 下调的34个， mRNA 2516个， 其中上调的1335个， 下调的1181个。

2. 3 生存分析 应用KM曲线法绘制胃癌特异性miRNA生存曲线， 结果发现miR-17， miR-139， miR-323b， miR-365a， miR-551b， miR-7705， miR-877和miR-944等8个miRNA的差异表达与胃癌患者的生存时间密切相关。

2. 4 胃癌miRNA靶基因筛选及其功能分析 通过miRDB、miRTarBase和TargetScan， 检索以上关键miRNA靶基因结果表明， 三个数据库均能检索到的靶基因494个， 其中有54靶基因为胃癌差异表达基因。采用KOBAS 3.0对54个靶基因进行KEGG通路及GO功能分析， 结果表明靶基因主要富集在“pathways in cancer”， “MicroRNAs in cancer”， “MAPK signaling pathway”， “cell cycle”以及“apoptosis”等肿瘤相关通路， 见表1;及“biological regulation”， “cell”， “cellular process”， “regulation of biological process”和“regulation of metabolic process”等功能关系密切， 见表2。另外， 生存分析结果表明， 靶基因ABCA1， DCC， FAM129A， KIF23， KPNA2， POLQ和TXNIP与胃癌患者的生存密切相关。

3 讨论

目前， miRNA数据库（miRbase）中收录已识别的miRNA超过2500个， 与多种肿瘤增殖、侵袭、转移及凋亡等相关。有研究表明， miRNA失调与胃癌发生、发展及预后密切相关。miR-130， miR-1266， miR-1207-5P及miR-1182促使胃癌细胞增殖与转移[5， 6]。miR-15b， miR-16， miR-34， miR-181b， miR-181c和miR-497在胃癌中呈低表达， 促使基因BCL-2的表达， 抑制胃癌细胞凋亡[7]。miRNA与胃癌细胞增殖转移等相关研究已取得一定的进展， 而与胃癌预后相关研究较少。

本研究通過生存分析发现， 8个miRNA的表达与胃癌患者生存时间显著相关。其中miR-139， miR-323b， miR-365a及miR-551b高表达预示患者生存时间较短;miR-17， miR-877， miR-944， miR-7705， 高表达者预后较好。研究表明， 以上miRNA与肿瘤发生发展均密切相关。Pan等[8]发现， miR-944可调控MACC1/Met/AKT信号通路阻止EMT的形成， 从而抑制胃癌细胞转移。Zhang等[9]发现， miR-139可调控靶基因JUN表达， 参与胃癌发生发展。Wei等[10]发现miR-551b在卵巢癌干细胞中表达上调， 抑制抑癌基因Foxo3和TRIM31的表达。而有研究则发现miR-551b在胃癌中呈低表达， 抑制胃癌细胞增值和侵袭， 认为可能是通过诱导胃癌细胞自噬性凋亡[11]。郭水龙等[12]证实， miR-365可通过调控靶基因E2F2表达参与胃癌发生。另外相比正常组织， miR-17胃癌中呈高表达， 与胃癌大小、Lauren分型、pTNM分期相关[13]。此外研究表明， miR-323b高表达可诱导肺腺癌细胞转移导致不良预后[14]。刘寒梢等[15]通过miRNA表达谱芯片研究发现miR-877可作为结直肠癌筛查和早期诊断的指标。研究发现， miR-7705与膀胱癌发生相关[16]。以上研究均未涉及miR-944， miR-139， miR-551b， miR-365， miR-17差异表达与胃癌预后相关性。同时miR-323b， miR-877， miR-7705与胃癌相关性亦未见报道。本研究结果表明miR-944， miR-139， miR-551b， miR-365， miR-17与胃癌患者生存显著相关， 可作为预后相关因子;miR-323b， miR-877及miR-7705与胃癌发生、预后紧密相关， 可能在胃癌早期诊治及预后监测等方面发挥重要作用。

此外， KEGG信号通路及GO功能分析结果表明， miRNA靶基因主要富集在肿瘤相关通路及功能上。故认为miRNA可能通过调控其靶基因表达水平， 间接调控或参与以上肿瘤相关通路和功能， 在胃癌中发挥重要的作用。通过肿瘤基因数据库（allOnco）发现， E2F1， CDKN1A等靶基因表达与胃癌确切相关。另外， ABCA1， TXNIP， KIF23等靶基因与胃癌患者总生存率显著相关。

本研究利用TCGA数据库中大样本的胃癌芯片及临床数据， 采用可靠的生物信息学方法， 识别多个与胃癌发生、发展及预后密切相关的miRNA及其靶mRNA， 为胃癌的诊断、治疗及预后提供新的潜在的生物标志物。

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[收稿日期：2018-12-11]