固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱法测定尿液中10种单羟基多环芳烃

商婷 赵灵娟 李佩 曾祥英 于志强

摘 要 通过检测人体尿液中多种羟基多环芳烃（OH-PAHs）的浓度可全面评估多环芳烃（PAHs）在人体的负荷水平。本研究建立并优化了一种基于固相支撑液液萃取（SLE）的前处理技术，在此基础上，利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定人体尿液中的10种OH-PAHs。尿样采用硅藻土SLE柱进行富集净化，二氯甲烷-正己烷（3∶7， V/V）混合溶液作为目标化合物的洗脱液。前处理优化结果表明，与传统方法相比，本方法具有较好的回收率，同时可有效降低生物基质的干扰。本方法在3个加标浓度水平（10、50和100 μg/L）下的回收率为88.5%～120.9%，重复性精密度范围为1.6%～8.1%。检出限与定量限分别在0.06～0.3 μg/L和0.2～1.0 μg/L之间。本方法成功用于广东省小学生尿液中OH-PAHs的测定， 结果表明，2-OHN是最主要的检出化合物，最高浓度达到4.83 μg/L。

关键词 单羟基多环芳烃; 尿液; 固相支撑液液萃取; 液相色谱-串联质谱

1 引 言

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中具有两个或两个以上苯环的一类碳氢化合物，其主要来源是煤、石油、木材等不完全燃烧或热裂解产物[1]。PAHs可通过呼吸道、皮肤和消化道等多种暴露途径进入人体，经体内代谢形成羟基多环芳烃（OH-PAHs），并以葡萄糖醛酸、硫磺酸结合物的形式主要通过尿液排泄[2]。由于它们具有潜在的“三致”（致癌、致畸、致突变）效应以及在全球分布的广泛性[3]，PAH对人体健康的潜在危害成为世界各国广泛关注的环境污染问题，人体内暴露水平的评估是开展PAHs健康风险评价的重要基础科学数据。

已有研究显示，尿中PAHs代谢物的测定通常与PAHs暴露密切相关[4]。由2～4个苯环组成的分子量较小的OH-PAHs，主要通过尿液排泄，而分子量较高的OH-PAHs（苯环数量>4）主要通过粪便排泄[5，6]。由于PAHs的暴露途径复杂多变，各种暴露途径对人体内暴露的贡献难以准确评估，因此，人体尿液中OH-PAH的测定成为评价PAH内暴露水平的重要生物标志物。目前，固相萃取（SPE）[6～11]与液液萃取（LLE）[12～17]是应用最广泛的样品前处理方法。SPE具有重现性稳定以及装置价格合理、易于获取等特点，但样品前处理使用相应的萃取柱时需活化、平衡和清洗等步骤，耗时耗力。LLE常用溶剂有戊烷、二氯甲烷和正己烷等，选择性高，分离效果较好，但操作复杂，溶剂使用量大，且易产生乳化现象导致重复性较差，且上述前处理技术存在目标化合物回收率不稳定、生物基质干扰严重等技术难点，无法满足流行病学大样本量研究的需求，因此，开发快速、高效的前处理技术成为OH-PAHs内暴露研究的重要内容。

SLE柱采用了特殊工艺处理过的硅藻土，拥有最大的比表面积和最低的表面活性，能提供一个理想的液液分配的支撑表面，可代替大部分传统的LLE方法[18]。在传统LLE方法基础上，SLE方法利用分析物在两相中不同的溶解度和分配比，采用经过高度改良的具有高比表面积的多孔硅藻土作为吸附剂，结合其吸水性强、化学惰性等特点，快速附样品基质中的水分，使目标物与水分分离，具有不易产生乳化现象、基质效应降低和需要样品量少等优点[19]。样品前处理时，使用相应的萃取柱，仅需上样和洗脱两步，即可从水相中萃取目标化合物。当加入水性生物样品时，样品在填料的表面扩散并被吸收，从而形成萃取界面，相当于LLE的界面，当与水不相溶的有机溶剂加入后，目标分析物被有机溶剂溶解并收集下来。相较于LLE、SPE等传统尿液前处理方法，SLE可有效提高样品的提取能力和效率，已广泛应用于人体尿液和血液样品的前处理[20～28]，如Meunier等[28]用甲基叔丁基醚提取血浆样品的醛固酮，方法方便简单。Liu等[23]利用正己烷萃取人体血液和尿液中的多环麝香，无需调节pH值和盐度，样品制备时间显著缩短（～15 min）。上述研究结果表明，利用SLE方法可以对生物体液中的污染物进行高通量分析。

本研究选择人尿液中的1-羟基萘（1-OHN）、2-羟基萘（2-OHN）、2-羟基芴（2-OHF）、3-羟基芴（3-OHF）、1-羟基菲（1-OHPhe）、2-羟基菲（2-OHPhe）、3-羟基菲（3-OHPhe）、4-羟基菲（4-OHPhe）、9-羟基菲（9-OHPhe）和1-羟基芘（1-OHP）共10种OH-PAHs为目标物，通过SLE洗脱溶剂的筛选和优化，确定前处理富集净化方法，然后使用LC-MS/MS 技术对其进行定性和定量分析，为尿液中常见的PAHs代谢产物检测提供了科学依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1100型液相色谱仪（LC，美国Agilent公司）-API4000三重四极杆质谱仪（MS/MS，美国AB SCIEX公司）; HeraeusTM LabofugeTM200台式离心机（美国Thermo Fisher公司）; 氮吹仪（美国Pierce公司）; 12孔固相萃取装置（美国Supeclo公司）; Milli-Q Unique-R10超纯水系统（美国Millipore公司）; 0.2 μm聚四氟乙烯膜滤头（上海安谱科学仪器有限公司）; 5-mL SLE固相支撑液液萃取小柱（瑞典Biotage公司）。

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正戊烷、甲苯和甲醇等有機溶剂均为色谱级（99.9%，德国Merck公司）; 醋酸钠和冰醋酸 （99.97%，美国Tedia公司）; HCl（质量分数为37%，德国 Sigma-Aldrich 公司）; β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶（美国Sigma公司，含122400单位/mL β-葡糖苷酸酯酶和3610 单位/mL芳基硫酸酯酶）; 实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

10种OH-PAHs标样（1-OHN、2-OHN、2-OHF、3-OHF、1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe、9-OHPhe和1-OHP）均购于美国Supelco公司; 同位素标记的标样（D8-1-OHN和D9-1-OHP）来自美国剑桥同位素实验室。

2.2 尿液样品采集

尿液样本的采集对象为广州市某小学四年级学生，所有志愿者均自愿参加，并在家长的引导下签署同意书，本研究随机选取了20例尿液样本进行检测，对方法应用进行验证。尿液样本采集后保存于预先处理过的聚乙烯塑料瓶中，于80℃放置备用。

随机采取实验室志愿者（22～28岁）尿液10例，每例取10 mL进行混合，形成的混合尿液基质用于方法优化。

2.3 样品前处理

样品置于室温下解冻后，3000 r/min离心10 min，取上清液，准确量取2 mL，加入10 ng回收率指示物（D8-1-OHN和D9-1-OHP），加1 mol/L HCl溶液与醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节样品至pH 5.0，加β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶20 μL，充分混匀，置于恒温振荡器中于37 ℃下避光酶解16 h。将酶解后的样品加入固相支撑液液萃取小柱中，施加2～10 s的真空或正压，等待5 min，使样品分散并充分吸附于填料表面。以5 mL二氯甲烷-正己烷（3∶7， V/V）混合溶液作为洗脱溶剂，连续洗脱3次，合并收集到的洗脱液进行氮吹，以甲醇定容至400 μL。用0.2 μm的尼龙膜过滤后，于20℃保存， 备用。

2.4 仪器分析

采用Eclipse-C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 美国Agilent公司）为色谱分析柱， 进样量为10 μL， 以水（A）和甲醇（B）为流动相， 流速为0.6 mL/min， 梯度洗脱程序： 0～5 min， 60% B; 5～14 min， 60%～78% B; 14～21 min， 78%～85% B; 21～30 min， 85%～100% B; 30～35 min， 100% B; 35～39 min， 100%～60% B; 39～45 min， 60% B。质谱检测采用电喷雾离子源（ESI）， 负离子模式， 电压4500 V， 离子源温度450℃， 雾化气压力50 psi， 辅助气压力60 psi， 窗帘气压力30 psi; 采用多反应监测模式（MRM）。各目标化合物保留时间和定性定量离子对见表1。

3 结果与讨论

3.1 洗脱溶剂的优化

用于SLE柱的洗脱溶剂需与水不混溶，同时对OH-PAH具有良好的溶解性，因此溶剂的选择主要取决于目标物的溶解度和极性等特性。对于非极性化合物，非极性溶剂（如庚烷、戊烷、己烷）较为理想，而弱极性化合物，需选择有一定极性的有机溶剂，如甲基叔丁基醚、二氯甲烷或乙酸乙酯。目标OH-PAHs的pKa值在8.0～9.2之间，具有弱极性。基于此，选取正己烷（Hex）、甲苯（MB）、戊烷（Pen）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtAC）、甲基叔丁基醚（MTBE）作为洗脱溶剂进行优化，通过10种OH-PAHs的回收率进行评价。

不同溶剂体系对10种OH-PAHs回收率的影响如图1所示，每种溶剂对OH-PAHs都有一定洗脱效率，其中DCM对各目标化合物的回收率均较理想。但由于DCM極性强，洗脱能力随之增强，因此洗脱下来的化合物相对较多，在LC-MS/MS进样时发现具有较多的非目标化合物被检测到，因此本研究中进一步考虑采用Hex-DCM混合体系，并对Hex-DCM不同配比时的混合溶剂的洗脱能力进行考察。结果表明，当洗脱溶剂Hex-DCM的配比为7∶3（V/V）时，所有目标物的回收率均理想，且色谱峰的干扰较小; 当DCM配比增加时，回收率无明显提高而干扰峰增加。最终选择DCM-Hex（3∶7， V/V）混合溶剂作为洗脱溶剂。

对洗脱溶剂的使用量进行了优化。洗脱溶剂使用量对回收率的影响见图2， 采用1 × 5 mL混合溶剂洗脱目标化合物，除1-OHP外，其余化合物回收率均高于90%， 使用3×5 mL混合溶剂时10种OH-PAHs的回收率均高于95.0%。因此洗脱次数最终设定为3次，优化的洗脱液的体积为15 mL。

3.2 方法评价

尿液基质为10例志愿者尿液的等体积混合液。采用标准加入法考察本方法的回收率，由于混合尿液基质中广泛存在OH-PAHs，因此同时进行加标基质和空白基质的前处理，每个加标浓度进行6次重复实验。从回收率、重复性及基质效应等3方面对建立的方法进行评价，并与目前广泛使用的固相萃取方法进行对比。

评价方法中分别进行低浓度（10 μg/L）、中浓度（50 μg/L）和高浓度（100 μg/L）的加标实验，同时依据文献[11]中的报道，通过手动SPE装置、全自动SPE装置流程进行尿液前处理，以便进行比对。不同方法中目标化合物的回收率见表2。结果表明，SLE前处理方法中，各目标化合物在10、50与100 μg/L加标浓度下的回收率在88.5%～120.9%之间，相对标准偏差<6.7%; 手动SPE的回收率在804%～940%之间，自动SPE的回收率在76.8%～107.3%之间。 与手动SPE、自动SPE相比，本方法加标回收率更高，稳定性也较好。

通过混合尿液基质加标与溶剂标样同时检测，基质效应计算公式如下：

其中， ME为基质效应; Area1为混合基质加标后目标物检测的响应峰面积; Area0为混合基质中目标物检测的响应峰面积; Area2为溶剂标样中目标物检测的响应峰面积。ME<0，表示有基质抑制效应; ME>0，表示有基质促进效应; ME=0，表示无基质效应。结果表明（表3），SLE各化合物的基质效应在4.1%之间，均呈现基质抑制效应，但除了2+3-OHF与1+9-OHPhe外，基质效应均较小。与手动SPE的44.2%～21.6%和自动SPE的74.9% ～39.1%相比，基质效应明显降低。引起LC-MS/MS中基质效应的内源性成分（如盐、蛋白质、肽类和磷脂等）在这些溶剂中不可溶。因此，分析物被洗脱下来，而基质仍保留在硅藻土吸附剂的水相中，被有效地从最终萃取物中去除。

表4列出了所有分析物的回归方程、重复性、检测限和定量限。各化合物都呈现了良好的线性，相关系数（R2）均高于0.993。检出限与定量限分别在0.06～0.3 μg/L和0.2～1.0 μg/L之间，各化合物的日内（n=6）偏差与日间（n=6）偏差在1.6%～8.1%之间。OH-PAHS标准物的总离子流图见图3。

目前，用于OH-PAHs的检测方法主要有HPLC、GC-MS和LC-MS/MS。方法的回收率和灵敏度除仪器自身的检测能力外，前处理过程也在很大程度上影响分析方法的回收率及灵敏度。Jongeneelen等[29]采用SPE对尿样中1-OHP进行富集，回收率仅为 78%±2%，尿样基质干扰大。Campo等[12]用正己烷进行LLE萃取，在此基础上通过甲硅烷基化试剂进行衍生化，GC-MS方法检测的LOD在0.1～1.4 μg/L之间。Jacob等[14]采用戊烷-乙酸乙酯（9∶1， V/V）混合溶剂萃取出尿液样品中的OH-PAHs，随之将代谢物转化为五氟苄基醚衍生物后， 利用LC-MS/MS进行检测， 方法灵敏度高，LOD可低至0.01～0.50 μg/L。但这些方法需要进行分析物的衍生化，操作繁琐耗时，衍生化反应的稳定性要求较高。Fan等[13]建立了一种利用戊烷和甲苯的混合溶剂萃取OH-PAHs的方法，减少了基质干扰并显著提高了方法灵敏度，LOD范围为1.72～17.47 ng/L，但需要加入AgNO3溶液以降低PAH硫化物的干扰，操作相对较为复杂，不适用于流行病学大队列的研究需求。本方法与文献报道的其它方法相比，不需要进行衍生化，操作简单快速，且检出限较低。

3.3 方法的实际应用

应用本方法对广东省某小学志愿者的20例尿样进行了检测。由表5可见，所有目标物均有检出，2-OHN是最主要的检出化合物，最高浓度达到4.83 μg/L。目标物的平均浓度分别为2-OHN 1.16 μg/L、1-OHN 0.62 μg/L、2+3-OHF 0.21 μg/L、2-OHPhe 0.08 μg/L、3-OHPhe 0.11 μg/L、1+9-OHPhe 0.10 μg/L、4-OHPhe 0.02 μg/L和1-OHP 0.15 μg/L。上述结果表明，本方法可用于人体尿液中OH-PAHs的检测。

4 结 论

建立了SLE富集、净化人体尿液中多种 OH-PAHs， 结合LC-MS/MS进行检测的方法。 建立的前处理技术无需对SLE柱进行预活化，只需将2 mL尿液样品酶解后载入柱中，用3×5 mL二氯甲烷和正己烷（3∶7，V/V）的混合溶剂进行洗脱，方法简单、快速。与目前广泛使用的SPE等前处理技术相比，SLE方法具有回收率高且稳定、生物基质干扰较小等显著优势，可满足人体尿液中10种OH-PAHs的分析需求。

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