O2/CO2气调下西兰花能量代谢与贮藏品质的关系

王 亮，陈 勇，郭衍银*，员丽苹，刘莎莎，张玉笑，张新华

（山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049）

西兰花因其低热量、高膳食纤维及丰富的抗氧化物质，深受消费者喜爱[1]。然而，西兰花属典型的呼吸跃变型蔬菜，采后代谢十分旺盛，极不耐藏，常温下2～3 d即发生褪绿、花蕾开放及黄化，导致花球营养成分含量急剧下降，同时，西兰花组织鲜嫩多汁，花球部分基本无保护层，这使得西兰花在贮藏过程中极易失水萎蔫、耐贮性差，严重影响其使用价值和市场价值[2]。为此，国内外学者对西兰花保鲜做了大量研究，如郭香凤等[3]研究表明低温冷藏（4 ℃）可显著抑制西兰花净菜组织的褪绿黄化和褐变，减缓组织中蛋白质、抗坏血酸及可溶性固形物等营养物质含量的下降，较好地保持细胞膜的完整性，有效地抑制西兰花组织的衰老和品质劣变。Xu Chaojiong等[4]研究发现5 ℃、体积分数21% O2＋10% CO2气调有利于西兰花保持较高的萝卜硫苷和醌还原酶活性，维持西兰花感官品质。Ma Gang等[5]研究表明5 μL/L 1-甲基环丙烯处理可延缓西兰花黄化并且抑制乙烯的产生，从而有效延缓西兰花的衰老。Alvarez等[6]研究发现对西兰花壳聚糖涂膜可有效抑制微生物的繁殖，达到较好的保鲜效果。本课题组前期研究表明，相较于一般气调，O2/CO2气调表现出独特的优势[7-8]，西兰花在0、10、20 ℃条件下分别保鲜49、31、14 d，保鲜期均比同温度下的其他气调处理组长[9]，但具体机理特别是O2/CO2气调对西兰花能量代谢的影响尚缺乏深入探讨。ATP作为细胞的能量货币，是细胞功能代谢和生存能力的主要决定因素。研究表明，采后果蔬的衰老与果蔬体内能量状况有关[10]。如较高的能量水平可维持南果梨细胞膜稳定性、减少衰老过程中冷害和褐变的产生[11]；桃果实组织的能量状态在维持细胞膜的完整性中起重要作用[12]；荔枝果皮褐变与ATP水平较高和电导率较低有关[13]。

为此，本实验以西兰花为材料，研究不同比例O2/CO2气调对西兰花能量、关键酶活力及品质指标的影响，探讨O2/CO2气调环境下西兰花能量代谢和保鲜品质的关系，以期从能量代谢角度阐明O2/CO2气调对西兰花的保鲜机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试的西兰花采自山东省寿光市刘家茅坨村，采收后立即运到山东理工大学农业工程与食品科学学院农产品贮藏实验室冷库内，3 ℃预冷12 h后，选取花球直径13～15 cm、花球紧密、色泽相似、没有病虫害和机械伤的西兰花进行气调处理。

2,4-二硝基苯肼 上海展云化工试剂有限公司；偏磷酸、冰醋酸、氯化镁 天津致远化学药剂有限公司；浓硫酸、琥珀酸钠 国药集团化学试剂有限公司；2,6-二氯酚靛钠、甲硫酚嗪、还原型细胞色素c、丙酮酸钠、二硫苏糖醇、三磷酸腺苷 上海索莱宝生物科技有限公司；高氯酸 上海桃浦化工厂；甲醇（色谱纯）烟台市双双化工有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1750型紫外-可见分光光度计 日本岛津国际贸易有限公司；600e型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配有紫外检测器）美国Waters公司；HP-2132便携式色差仪 深圳汉谱光彩科技有限公司；PHS-25型pH计 上海存联工贸有限公司；DW-FW351型低温冰箱 中科美菱低温科技有限责任公司；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；AL-1D4型精密分析天平 德国梅特勒-托利多仪器有限公司；GL-20G-2型台式多功能高速冷冻离心机 上海安亭仪器制造厂。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

将预冷后的西兰花分为4 组，每组30 个。将4 组西兰花分别放入气调箱中，并放入（10.0±0.5）℃冷库中，然后分别通入不同比例的O2、CO2，4 组气体的比例（均以体积分数计）分别为：20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2、80% O2＋20% CO2和自然空气（CK）。具体通气操作参照郭衍银等[8]的方法进行。每个处理组3 次重复，即每个气调箱放10 个西兰花。贮藏过程中，每4 d取样1 次，进行相应指标的测定，当西兰花30%出现黄化或腐烂或异味时，即终止贮藏[14]。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 pH值的测定

pH值采用pH计法[15]测定。

1.3.2.2 琥珀酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、细胞色素c氧化酶活力的测定

琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力参照Ackrell等[16]的方法，通过分光光度法测定；丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH活力参照Nemeria等[17]的方法测定；细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活力参照熊杰等[18]的方法测定。

1.3.2.3 能荷的测定

ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量参照Zhou Qian等[19]的方法测定。样品先用10 mL 0.6 mol/L高氯酸在冰浴中提取，采用HPLC仪测定ATP、ADP和AMP的含量。色谱柱为ODS柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；检测波长为254 nm。流动相A为由0.06 mol/L磷酸氢二钾和0.04 mol/L磷酸二氢钾配成的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），流动相B为100%甲醇（色谱纯），洗脱程序为：0～7 min，100%（体积分数，下同）流动相A；7～9 min，80%流动相A；9 ～10 min，75%流动相A；10 min，100%流动相A。流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。重复3 次，结果以鲜质量计。能荷按照下式进行计算。

式中：ATP、ADP及AMP分别表示各自的含量/（μg/g）。

1.3.2.4 VC含量的测定

VC含量采用2,4-二硝基苯肼法比色法[20]测定，结果以鲜质量计。

1.3.2.5 色调的测定

西兰花色调的测定参考Li Dong等[21]的方法，使用便携式色差计测定a、b值。当a＞0且b＞0时，H=tan-1（b/a）；当a＜0且b＞0时，H=180°＋tan-1（b/a）。

1.3.2.6 水分质量分数的测定

水分质量分数采用干燥法进行测定。

1.4 数据统计与分析

所得数据使用SPSS 13.0软件进行最小显著性差异法分析及Pearson法进行相关性分析，P＜0.05表示差异显著；采用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中pH值的影响

图1 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中pH值的影响Fig. 1 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on pH of broccoli during storage

细胞内pH值是影响细胞生理代谢的重要因素[22]。如图1所示，CK组在贮藏期间pH值基本维持平稳状态，但不同O2/CO2气调处理的西兰花pH值呈现出不同的变化趋势。80% O2＋20% CO2处理组的pH值在贮藏期间整体低于CK组，但也基本处于稳定水平；随着CO2比例的升高，西兰花pH值呈现逐渐降低趋势，如80% O2＋20% CO2、50% O2＋50% CO2和20% O2＋80% CO2处理组的西兰花在整个贮藏期间平均pH值分别为6.54、6.19和6.04，分别比CK组（6.62）低1.21%、6.50%和8.76%。

2.2 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中PDH、SDH和CCO活力的影响

图2 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中PDH（A）、SDH（B）及CCO（C）活力的影响Fig. 2 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on PDH (A), SDH (B)and CCO (C) activities of broccoli during storage

PDH是呼吸代谢过程中丙酮酸进入三羧酸循环的关键酶，是催化丙酮酸氧化脱羧的重要酶之一，在新陈代谢调节中起着极其重要的作用[23]。由图2A可知，各组PDH活力在贮藏过程中均呈先上升后下降的趋势，但其峰值出现的时间不同，CK组和80% O2＋20% CO2、50% O2＋50% CO2、20% O2＋80% CO2处理组的PDH活力峰值分别出现在第8、12、16、12天，说明适宜的O2/CO2气调处理能延缓PDH活力峰值的出现。同时，8 d之后各组PDH活力在相同贮藏时间时均存在显著差异（P＜0.05），整个贮藏期间CK、20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO24 个处理组PDH活力平均值分别为15.70、8.38、16.90、15.89 U/（g·min）。

SDH是三羧酸循环中一种重要的酶，其催化琥珀酸脱氢转化成延胡索酸，促使黄素腺嘌呤二核苷酸接受脱下的H＋，最终氧化黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体产生ATP，为生命活动提供能量。CCO是呼吸链的末端酶，能够将电子传递给O2，与能量的产生密切相关[23]。由图2B、C可知，各组西兰花在贮藏过程中SDH、CCO活力变化趋势相似，均是先上升后降低，只是两者活力峰值出现的时间稍有差异，SDH活力的峰值主要出现在第12天，而CCO则主要出现在第8天。就贮藏期间SDH和CCO活力的平均值而言，20% O2＋80% CO2处理组最低，分别为0.015、1.4 U/（g·min），低于CK组（分别为0.016、1.7 U/（g·min））；50% O2＋50% CO2处理组最高，分别为0.018、1.9 U/（g·min），分别比CK组高12.5%和11.76%。

对于PDH、SDH和CCO活力，80% O2＋20% CO2处理组在贮藏前期均高于50% O2＋50% CO2处理组，但贮藏后期则显著低于50% O2＋50% CO2处理组（P＜0.05），表明高比例O2虽可促进西兰花贮藏前期PDH、SDH和CCO活力升高，但缺乏持续性和稳定性，造成贮藏后期酶活力迅速下降。

2.3 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中能荷的影响

图3 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中能荷的影响Fig. 3 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on energy charge of broccoli during storage

植物体内的能荷大小可反映其体内的能量水平和产生状况[24]。如图3所示，各组西兰花体内能荷在贮藏过程中均呈下降趋势，其中CK组与20% O2＋80% CO2处理组能荷下降最为迅速，16 d内分别下降了56.08%与46.57%。相比而言，50% O2＋50% CO2与80% O2＋20% CO2处理组的西兰花能荷下降较为缓慢，16 d内下降了19.32%和30.68%，这两组的能荷在0～12 d下降缓慢，从0 d时的0.81分别下降到0.73和0.75，仅分别下降了9.9%和7.4%，之后（12～28 d）能荷迅速下降，分别下降了53.34%和63.90%。

2.4 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中VC含量的影响及与能荷的相关性分析

图4 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中VC含量的影响Fig. 4 Effect of modified O2/CO2 controlled atmospheres on ascorbic acid content of broccoli during storage

西兰花体内VC含量的高低可作为评价其贮藏品质的有效指标[25]。如图4所示，随着贮藏时间的延长，各组西兰花VC含量均呈下降趋势，但下降速率不同。其中，CK组VC含量呈线性下降趋势，16 d内下降了72.7%；50%O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2处理组在贮藏前期下降较慢，0～16 d时分别下降了23.5%和28.9%，16～28 d时则分别下降了39.9%和42.8%。

表1 西兰花VC含量与能荷的相关性分析（以贮藏16 d内的数据计算）Table 1 Correlation analysis of ascorbic acid and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

相关性分析表明，贮藏期间各处理组VC含量与能荷之间存在明显的正相关性（表1），除80% O2＋20% CO2处理组的相关系数为0.732外，其余处理组的相关系数范围为0.96～0.98，表明贮藏期间西兰花能荷水平与VC含量密切相关。

2.5 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中色调的影响及与能荷的相关性分析

H值由高到低的变化反映了西兰花逐渐黄化的过程[26]。随着贮藏时间的延长，各处理的H值均呈下降趋势（图5），其中CK组下降最快，16 d内下降了20.87%。气调处理减缓了西兰花H值的降低，20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2处理组在16 d内分别下降了12.11%、11.05%和12.54%，表明合适的CO2比例对叶绿素降解具有很好的抑制作用。

图5 O2/CO2气调对西兰花色调的影响Fig. 5 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on H value of broccoliduring storage

表2 西兰花色调与能荷的相关性分析（以贮藏16 d内的数据计算）Table 2 Correlation analysis of color value and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

由表2可知，除80% O2＋20% CO2处理组的西兰花色调与能荷相关系数为0.799外，其余组均高于0.80，CK组的相关系数高达0.986，表明能荷与西兰花色调存在很高的相关性。

2.6 O2/CO2气调对西兰花贮藏过程中水分质量分数的影响及与能荷的相关性分析

图6 O2/CO2气调对西兰花水分质量分数的影响Fig. 6 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on water content of broccoli during storage

西兰花组织鲜嫩多汁，在贮藏期间极易失水导致品质恶化，水分质量分数可作为评价西兰花品质的重要指标。如图6所示，贮藏期间各组西兰花的水分质量分数呈下降趋势，其中CK组下降最快，16 d内下降了6.71%，高于20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2处理组（分别为5.64%、2.76%和4.55%）。相比较而言，50% O2＋50% CO2处理组水分质量分数下降最慢，0～20 d范围内仅下降了4.17%，明显低于80% O2＋20%和20% O2＋80% CO2处理组（分别为5.84%和7.84%）。相关性分析（表3）表明，各处理组水分质量分数与能荷之间存在显著或极显著的相关性（P＜0.05，P＜0.01），除80% O2＋20% CO2处理组相关系数为0.888外，其余组均高于0.90。

表3 西兰花水分质量分数与能荷的相关性分析（以贮藏16 d内的数据计算）Table 3 Correlation analysis of water content and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

3 讨 论

本课题组前期研究发现，10 ℃下，50% O2＋50% CO2处理能很好地保鲜西兰花[9]，为了探讨和对比O2/CO2气调对西兰花贮藏期间能量代谢和贮藏品质的关系，本实验除设置50% O2＋50% CO2处理组外，还设置了20% O2＋80% CO2、80% O2＋20% CO2两个极限条件，目的在于探究O2/CO2气调下保鲜效果与能量水平之间的关系。

pH值是细胞生理活动的重要调节因素，它不仅能够调节细胞的一些酶活性，也调节细胞内一些生理活动和代谢过程[27]，同时，植物体内的呼吸代谢相关酶活性决定着能荷水平。Mathooko[28]认为，高浓度CO2可引起细胞pH值下降，进而使得整个呼吸途径出现紊乱，如较低pH值可造成SDH活性降低，造成琥珀酸和苹果酸的积累，致使三羧酸循环难以持续。Blanch等[29]指出，高浓度CO2处理可增加草莓细胞膜通透性、加速细胞膜降解，并降低ATP含量及能量的利用效率。本研究结果表明，与50% O2＋50% CO2处理组相比，过高比例的CO2如20% O2＋80% CO2处理引起西兰花贮藏过程中pH值降低（图1），进而造成PDH、SDH和CCO活力的下降（图2）和能荷水平的降低（图3），与Mathooko[28]的研究结果一致。过高比例的O2如80% O2＋20% CO2处理虽在贮藏前期使PDH、SDH和CCO活力提高，但使其后期迅速下降，降低了贮藏期间西兰花后期的能量产生效率，同样不利于维持平稳而持续的能量供应。

郭衍银[8]、孙志文[7]等研究指出，高浓度O2不利于西兰花叶绿素的保持，而适当浓度的CO2则利于绿色维持，本实验西兰花色调变化结果与以上研究一致。随着贮藏时间的延长，CK组西兰花的色调迅速降低，而另外3 个处理组西兰花的色调虽有降低，但均高于CK组，进一步证实了CO2抑制叶绿素降解的作用。

Pan Yonggui等[30]研究表明，冷藏后木瓜体内能荷的降低导致冷害发生，且冷害指数与能量水平存在密切的相关性。刘亭等[31]研究结果表明，荔枝贮藏期间能荷水平与细胞膜通透性和果皮褐变指数呈明显的负相关。VC含量、色调以及水分质量分数作为西兰花品质指标，可直观评价西兰花贮藏条件的优劣。本实验结果表明，能荷水平与西兰花VC含量、色调及水分质量分数之间存在显著或极显著的正相关关系，CK、20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2、80% O2＋20% CO2处理组的能荷水平与VC含量之间相关系数分别为0.732～0.996，与色调之间的相关系数分别为0.799～0.986，与水分质量分数之间的相关系数分别为0.888～0.983。说明能荷水平可作为主要指标，综合评价西兰花贮藏条件的适宜性。

综上所述，50% O2＋50% CO2处理可调节西兰花体内pH值和呼吸关键酶活性，建立持续稳定的能量供应系统，并很好地维持西兰花贮藏品质；CO2过高或过低均影响贮藏期间西兰花能量的持续供应，并降低贮藏品质。相关性分析表明，西兰花能荷水平和VC含量、色调及水分质量分数具有很高的相关性，可作为优化西兰花贮藏条件的衡量指标。