热休克蛋白70与心肌缺血再灌注损伤大鼠心房颤动及心肌纤维化的关联

代菁 詹莉 张波 刘超

(1江汉大学附属医院暨武汉市第六医院，湖北 武汉 430015；2武汉市第八医院；3天津市胸科医院心血管病研究所)

缺血性心脏病是导致心房颤动(房颤)的主要诱因，心肌缺血再灌注损伤是心肌梗死患者再灌注治疗后的后遗症，直接导致患者心功能下降〔1～3〕。心肌缺血再灌注损伤的诱因有多种，如心肌抑顿、微血管痉挛、内皮细胞水肿、血栓脱落栓塞及炎症因子作用和原位血栓形成等〔4〕。心肌缺血再灌注损伤同样会导致心肌纤维化，其中心肌细胞外基质(ECM)的主要成分是心肌纤维细胞分泌的胶原纤维，对维持心脏的正常生理功能有重要作用〔5〕。在健康心脏中，肿瘤坏死因子(TNF)-α控制着心肌ECM降解与合成〔6〕。当在缺血缺氧状态下，机体中的EMC合成与降解会失衡，进而使心肌间质重构及心肌纤维化。当心肌发生纤维化后会对心脏功能产生严重的不良影响〔7〕。TNF-α主要在一些炎症性疾病如类风湿关节炎和病毒性心肌炎等中起重要作用〔8〕。同时，也是导致心肌功能损伤的主要原因，会导致心肌缺血再灌注后心肌灌流下降的主要因素，还会上调相关白细胞介素因子的表达，从而加重心肌缺血再灌注后心肌纤维化。热休克蛋白(HSPs)细胞是在生理或病理状态刺激下诱导合成的一种细胞内源性保护蛋白〔9〕。在应激状态下，其表达水平显著升高〔10〕。研究显示，在缺血再灌注损伤中HSP70会异常表达，并随着再灌注时间的延长而升高〔11〕。目前对HSP70与心肌缺血再灌注损伤大鼠房颤及心肌纤维化的关联还不清楚。本研究测定大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性及心肌和血清TNF-α表达和心肌组织HSP70蛋白表达，探讨HSP70与心肌缺血再灌注损伤大鼠房颤及心肌纤维化的关联。

1 材料与方法

1.1实验材料与试剂 选取雄性健康SD大鼠48只，体重180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。生长温度为(23±2)℃，环境湿度为45%～50%，光照时间为每天12 h，自由进食、进水，适应性饲养1 w。随机分为正常对照组、缺血30 min组、再灌注60 min组和再灌注120 min组，每组12只。SOD和MDA活性测定试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；HSP70抗体和TNF-α抗体购自Santa Cruz公司；TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自欣博盛公司。

1.2动物模型的建立 使用20%乌拉坦(7 ml/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，采用针形电极插入四肢以观测心电图。将大鼠气管切开，打开胸腔暴露心脏，穿过心肌浅层进行结扎。正常对照组：穿线但不结扎；缺血30 min组：穿线并结扎，以结扎线以下心肌颜色变暗为标志，证实已经造成心肌缺血；再灌注60 min组：处理步骤同缺血30 min组，待缺血30 min后松开结扎线，恢复再灌注60 min；再灌注120 min组：处理步骤同缺血30 min组，待缺血30 min后松开结扎线，恢复再灌注120 min。待以上各组处理结束后，采用摘除眼球法取血备检，同时摘取心脏备检。

1.3心电图监测 在动物模型建立的前一天开始进行24 h动态心电图监测，监测至实验结束。

1.4心肌组织中SOD和MDA的测定 在实验结束后，摘取大鼠心脏，用4℃生理盐水进行冲洗备用。准确称取0.2 g心肌组织，加入适量生理盐水，研磨成组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min，取上清液进行心肌组织SOD活性和MDA含量测定。按试剂盒说明书，采用化学扩增法测定SOD活性，用硫代正比妥酸(TBA)法测定MDA含量。

1.5血清中TNF-α表达检测 实验结束后，收集大鼠血液样本1 ml，3 000 r/min离心20 min。取上清液保存于-80℃备检。使用ELISA检测试剂盒测定血清TNF-α浓度。

1.6心肌组织中TNF-α和HSP70表达检测 采用Western印迹法检测心肌组织TNF-α表达。将选取的心肌组织样本剪切为细小碎片，称取20 mg心肌组织，加入200 μl组织裂解液。采用组织匀浆机对心肌组织进行匀浆，直至充分裂解。使用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测定。样本上样量为20 μg，使用10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分离，电泳结束后，将蛋白转移至硝酸纤维素(NC)膜上。采用5%的脱脂奶粉溶液对NC膜进行封闭后，加入1∶1 000的TNF-α和HSP70抗体4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，使用1∶100二抗室温孵育2 h。采用化学发光法对NC膜进行显色。分析目的蛋白和内参β-actin的Western印迹条带。

1.7统计学处理 采用SPSS20.0统计分析软件进行单因素方差分析或者重复测量的方差分析及LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1各组房颤持续时间 正常对照组未见房颤。缺血30 min组和再灌注各组房颤时间均逐渐升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组心肌组织中SOD活性 与正常对照组相比，心肌组织中SOD活性于缺血30 min开始降低至再灌注120 min达到最低值(P<0.05)。见表1。

2.3各组心肌组织中MDA含量 与正常对照组相比，心肌组织中MDA含量于缺血30 min开始升高至再灌注120 min达到最大值(P<0.01)。见表1。

2.4各组血清中TNF-α含量的测定 与正常对照组相比，缺血30 min组血清中TNF-α表达量显著增加(P<0.05)；与缺血30 min组相比，再灌注各组血清中TNF-α表达量显著增加，至再灌注120 min达到高峰(P<0.05)，见表1。炎症因子TNF-α异常升高是心肌缺血再灌注心肌纤维化可能因素之一。

表1 各组房颤持续时间、心肌组织SOD、MDA水平和血清TNF-α含量

与正常对照组相比:1)P<0.05；与缺血30 min组相比:2)P<0.05，3)P<0.01

2.5各组心肌组织中HSP70含量 与正常对照组相比，缺血30 min组心肌组织中HSP70蛋白表达显著增加，再灌注各组与缺血30 min组相比HSP70蛋白表达也明显增加，说明HSP70蛋白表达会随着心肌缺血再灌注损伤的加重而增加。见图1。

图1 各组心肌组织中HSP70表达

2.6各组心肌组织中TNF-α表达 心肌组织TNF-α在缺血再灌注各组中的表达均显著高于正常对照组，这与血清中TNF-α的表达规律相同。见图2。

图2 各组心肌组织中TNF-α表达

3 讨 论

再灌注损伤是缺血恢复血流灌注后心肌细胞转化为不可逆性损伤〔12〕。机体在心肌缺血后再灌注后会释放出大量内源性有害因子，如兴奋氨基酸和氧自由基等，同时也会释放出内源性保护因子如HSP70等。近年来关于心肌保护方面的研究，更多关注于HSP70的内源性保护途径〔13〕。HSP70是组织细胞受到氧化损伤后产生的一种应激蛋白。在临床心脏外科术后和心肌缺血再灌注动物模型都能检测到HSP70阳性表达，并被证实是由心肌缺血再灌注损伤导致的〔14〕。本研究结果提示，HSP70蛋白表达会随着心肌缺血再灌注损伤加重而增加，具有再灌注时间依赖性，证实HSP70蛋白与心肌缺血再灌注损伤发生与发展相关。同时，本研究结果证实了HSP70随着再灌注时间延长表达增强。在心肌缺血再灌注损伤的过程中，往往会导致房颤〔15〕。心肌缺血再灌注损伤中，氧自由基是导致缺血再灌注损伤的直接原因。氧自由基产生会损伤心肌细胞膜、破坏心肌细胞的结构及产生大量的脂质过氧化物〔16〕。MDA是氧自由基脂质过氧化的终产物，SOD是体内清除氧自由基的主要酶系。因此，MDA可以反映氧自由基含量和脂质过氧化程度的指标〔17〕。SOD可以作为反映机体抗脂质过氧化的能力。本研究说明心肌缺血再灌注后机体产生了大量的氧自由基，使机体中SOD的消耗量增加，机体内氧自由基酶性清除系统受到破坏，从而导致心肌损伤。心肌缺血再灌注大鼠心肌纤维化与TNF-α的异常高表达密切相关。在缺血再灌注后，心肌纤维化也是导致心功能降低的因素之一〔18〕。心肌纤维化是心肌ECM中胶原纤维过量聚积导致的，存在于多种心血管疾病中〔19〕。在心肌缺血再灌注时，心肌细胞会分泌过量的胶原纤维，增加心肌僵硬度，使心肌血流供应减慢，进一步加重心肌缺血。已有研究证实，动物注射TNF-α后，会导致心脏功能障碍、心力衰竭及心肌纤维化〔20〕。本研究结果说明炎症因子TNF-α的异常升高是心肌缺血再灌注心肌纤维化的可能因素之一。综上，心肌细胞内HSP70表达水平与心肌缺血再灌注大鼠房颤及心肌纤维化相关。同时，心肌缺血再灌注损伤会导致大鼠房颤，并通过加重炎症反应导致房颤和心肌纤维化。HSP70可作为心肌缺血再灌注损伤发展和恶化的重要标志。