麦冬皂苷D诱导十二指肠平滑肌舒张作用及机制

张建武 孙浪 刘鑫 罗林 李春臣 罗涛 梅雪

(川北医学院 1药学院，四川 南充 637100；2麻醉系；3基础医学院机能中心)

麦冬皂苷(OP)D对心脑血管和肝、肺具有保护作用，在抗衰老，抗肿瘤，抗炎，提高免疫和镇咳祛痰等多方面发挥活性作用〔1〕。研究〔2，3〕表明OPD亦有降血糖的作用，临床上常用于肺燥干咳，津伤口渴，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，心烦失眠，内热消渴，而且可以用于肠燥便秘的治疗〔4〕。临床上对治疗胃肠平滑肌过度收缩的药物主要以西药为主，如钙离子通道阻断药硝苯地平和抗胆碱药阿托品等，硝苯地平长期使用可引起负性肌力和负性传导，而阿托品由于其不良反应较大，在临床应用中受到一定的限制，因此，开发有效防治胃肠平滑肌痉挛、低毒、低残留的天然中草药意义重大〔5〕。本试验以家兔离体十二指肠平滑肌为研究对象，研究OPD对兔离体十二指肠平滑肌收缩的影响，并使用不同的工具药探讨OPD对离体十二指肠平滑肌产生影响的机制。

1 材料与方法

1.1动物 任意性别的健康四川大白兔(2.5～3.0 kg)，由川北医学院动物实验中心提供，实验动物许可证编号SYXK(川)2013-076。

1.2药物及试剂 OPD(成都曼斯特生物科技有限公司，纯度99.60%，批号：MUST-17022004)；二甲基亚砜(DMSO，北京索莱宝科技有限公司，批号：CAS67-68-5)；肝素(HP，成都市科华化工试剂厂，批号：CAS 9041-08-1)；钌红(RR，源叶生物科技有限公司，批号：CAS11103-72-3)；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，碧云天生物技术有限公司，产品批号：S0006)；盐酸维拉帕米注射液(上海禾丰制药有限公司，批号：43161001)。

1.3仪器 兔类通用实验器械；BL-420生物机能实验系统(四川成都泰盟公司)；FT-100生物张力传感器(四川成都泰盟软件有限公司)；HW-400E 恒温平滑肌槽(四川成都泰盟科技有限公司)；优普纯水/超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司)。

1.4OPD溶液的配置 称取OPD 0.1 mg，先加1 ml DMSO充分溶解，再加入9 ml台氏液，将其配成浓度为117 μmol/L的OPD溶液。

1.5家兔十二指肠平滑肌制备 取健康家兔，禁食24 h，用木槌猛击兔头枕部致死，迅速沿腹中线打开腹腔，每只家兔取十二指肠同一肠段，置于盛有室温台氏液的烧杯中，洗净肠内容物，之后将其剪成1～2 cm的肠管作为实验标本。

1.6肠管收缩活动的记录 打开 BL-420E生物机能实验系统，调零，定标，在1通道输入接口处连接张力换能器。调节恒温平滑肌槽，使水温保持在 (37±0.5)℃，将台式液加入预管内，药物管加入18 ml台氏液。将标本一端固定于 L 型通气钩上，另一端连接张力换能器，持续通入混合气体(95% O2+5% CO2)，每秒1～2个气泡，标准负荷1 g，平衡1 h，待肠管运动稳定后，开始进行试验。

1.7OPD对小肠平滑肌的影响

1.7.1OPD对家兔离体十二指肠平滑肌收缩的影响 待肠管收缩稳定达到实验要求后，累积加入已配好的OPD使其终浓度分别达到0.65×10-6mol/L(低浓度组)、1.30×10-6mol/L(中浓度组)，1.95×10-6mol/L(高浓度组)，加药间隔为8 min(每只肠管待其稳定时开始加药)，同时设置空白组，仅用含相同浓度DMSO的台氏液进行实验。观察肠道运动曲线的变化，用区间测量法测量加药前1 min和加药后第8 min的肠道收缩数据(平均收缩力、收缩振幅和收缩频率)。

1.7.2工具药预处理后OPD对家兔离体十二指肠平滑肌收缩作用的影响 待肠管收缩曲线稳定达到实验要求后，分别加入RR 10 μmol/L(RR组)，HP 50 mg/L(HP组)，L-NAME 100 μmol/L(L-NAME组)，维拉帕米0.1 μmol/L(维拉帕米组)，均孵育15 min后，再累积加入OPD使其终浓度分别达到0.65×10-6、1.30×10-6、1.95×10-6mol/L，加药间隔为8 min，记录加入OPD后肠管收缩的相关数据。

1.8统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差。

2 结 果

2.1OPD对家兔离体十二指肠平滑肌收缩活动的影响 加药后与加药前比较，低、中、高浓度组平均收缩力，中、高浓度组振幅均显著降低(P<0.05,P<0.01)。空白组加药前后各指标差异无统计学意义(P>0.05)。低、中、高浓度组加药前、后频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2RR、HP、L-NAME及维拉帕米预处理对OPD舒张十二指肠平滑肌的影响 与对照组比较，RR组及HP组平滑肌收缩力差异无统计学意义(P>0.05)。OPD 1.30×10-6mol/L及OPD 1.95×10-6mol/L时，与对照组比较，L-NAME组平滑肌收缩力均显著升高(P<0.05,P<0.01)；OPD 0.65×10-6、1.30×10-6、1.95×10-6mol/L浓度时，与对照组比较，维拉帕米组平滑肌收缩力显著降低(P<0.01)。见表2。

表1 OPD对家兔离体十二指肠平滑肌收缩活动的影响

与加药前比较：1)P<0.05，2)P<0.01

表2 各组平滑肌收缩力比较

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

胃肠动力紊乱性疾病(DGIM)、胃肠平滑肌功能紊乱、肠易激综合征的诊断以运动检测指标为基础，其运动障碍可以是胃肠本身的功能异常，也可能是其他系统疾病的结果。DGIM 患者往往存在着神经或肌肉解剖异常或生化及神经传导异常及肠道测压或肠道电活动的异常〔6〕。相关研究表明，小肠平滑肌毒蕈碱样胆碱能受体平衡的变化、L-型钙离子通道活力改变及Cajal间质细胞网络和数量的改变在小肠平滑肌功能紊乱发病机制中有重要意义，其中毒蕈碱样胆碱能受体，M1 受体主要通过鸟苷酸结合蛋白(G)g作用于磷脂酸肌醇系统激活磷脂酶C，生成三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)，从而引起平滑肌的收缩〔7〕。

Chen等〔8〕研究表明OPD可缓解高脂饮食诱导的代谢综合征，并改变小鼠肠道微生物群的结构，本实验采用了多种工具药进行实验机制的探究，其中HP可作用于IP3受体(IP3R)，IP3R 是广泛存在于各种细胞内质网的一种钙释放通道家族。当IP3R与 1，4，5 IP3和钙离子两种底物分子结合后，IP3R开放，钙离子便从内质网钙库释放到细胞质中〔9〕。本实验结果表明OPD作用途径与阻断IP3R导致平滑肌收缩途径无必然联系。

雷诺定受体(RyR)是存在于肌细胞肌质网和其他细胞内质网的胞内钙释放通道之一，钙离子集合后激活RyR1使通道在开放和关闭状态随机转换；进一步集合咖啡因则可将通道保持在开放状态。Ryanodine 结合于孔道侧壁，低浓度时可将通道锁定在亚电导状态(有部分离子流通过)，高浓度则阻断离子的通过〔10〕。为此，本实验用RR预处理兔离体十二指肠平滑肌，结果表明Ryanodine与IP3R并未介导OPD对十二指肠平滑肌的舒张作用。

神经递质一氧化氮(NO)通过激活平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶，使胞质内环磷鸟苷(cGMP)浓度增高，钙离子浓度下降，诱导胃肠平滑肌的舒张〔11～13〕。本实验预先用L-NAME处理离体十二指肠平滑肌，结果表明OPD可能是通过激活平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶从而诱导了平滑肌的舒张。

Qian等〔14〕实验证明，OPD对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)有一定的保护作用，其机制是：稳定线粒体膜电位，减少钙离子内流。此外，蒋凤荣等〔15〕实验也证明OPD能稳定线粒体膜电位，降低细胞通透性，防止钙离子内流增加，从而保护内皮细胞免于凋亡。本实验用工具药维拉帕米对离体小肠进行预孵，其作用机制是阻滞外源性钙离子经L-型钙离子通道进入细胞内，降低胞内的钙离子浓度，而钙离子是细胞内重要的第二信使，高浓度的钙离子可引起平滑肌收缩，低浓度钙离子可引起平滑肌舒张〔16〕，本实验结果表明OPD可能是通过抑制细胞的外钙内流从而引起离体家兔十二指肠平滑肌的舒张作用。

综上所述，OPD可浓度依赖性地抑制自发性肠平滑肌的收缩作用，作用机制可能为通过阻断L-型钙通道，抑制外钙内流最终导致细胞内钙离子浓度降低，从而降低了平滑肌的收缩作用，此外，OPD也有可能是通过激活平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶从而诱导了平滑肌的舒张。