涤痰汤对血管性痴呆大鼠海马NOX2/ROS通路、GSH、HO-1表达的影响

杨超 杨佳 刘玲

(1湖北中医药大学2016级博士研究生，湖北 武汉 430061；2湖北省中西医结合医院老年病科；3华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科；4湖北中医药大学第一临床学院 湖北省中医院)

血管性痴呆(VD) 是指由缺血性脑卒中、出血性脑卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。流行病学调查发现〔1〕，我国65岁以上人群VD的患病率为1.1%～3.0%。涤痰汤是临床治疗痴呆的经典方剂，可有效改善VD患者的认知功能障碍，但是涤痰汤治疗VD的具体作用机制尚不明确。慢性脑缺血是VD的重要病理基础之一，由慢性脑缺血引起的氧化应激失衡在VD的发病机制中发挥重要作用。本研究通过观察涤痰汤对VD大鼠动物行为学、海马组织病理学及氧化应激损伤的影响，探讨涤痰汤治疗VD的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康清洁SPF级Wistar大鼠40只，雄性，鼠龄8～10 w，体重(200±20)g，购于湖北省疾控中心，许可证编号：SCXK(鄂) 2008-0004。饲养于室温21～25℃、相对湿度为60%～65%、自然光照的SPF级实验室。自由进食和饮水，适应性喂养1 w后进行实验。

1.2药物 涤痰汤由制天南星8 g，制半夏8 g，炒枳实6 g，茯苓6 g，橘红5 g，石菖蒲3 g，人参3 g，竹茹2 g，甘草1.5 g，生姜5 g组成，购于湖北省中医院中药房，由湖北省中医院药剂科制备，分别浓缩成含生药量0.971 g/ml、0.485 g/ml两个不同浓度溶液，无菌条件装瓶，4℃冰箱储存备用。

1.3主要试剂 苏木素-伊红(HE)染色所需试剂由国家中医药管理局老年性痴呆(醒脑益智)重点研究室提供；RIPA裂解液(货号G2002)、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔(货号G23303)、HRP标记驴抗山羊(货号G23404)、HRP标记山羊抗小鼠(货号G23301)、HRP标记山羊抗大鼠(货号G23302)购于武汉谷歌生物科技有限公司；活性氧(ROS，货号：E004)、谷胱甘肽(GSH，货号：A006-1)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.4主要仪器设备 SA201 Morris水迷宫视频分析系统(江苏赛昂斯生物科技有限公司)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，V300型扫描仪(EPSON)。

1.5模型制备 动物适应性喂养1 w后，采用改良的大鼠双侧颈总动脉永久性结扎法制备VD大鼠模型：大鼠术前12 h禁食，6 h禁水，给予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g) 腹腔注射麻醉，将其仰卧位固定在手术台上，颈前部手术区域去毛，碘酒消毒，取颈前正中切口，钝性分离右侧颈总动脉，用0号手术线结扎右侧颈总动脉的近心端和远心端，用剪刀从中间剪断，依次逐层缝合。1 w后在同样条件下，结扎并剪断左侧颈总动脉。造模结束1 w后，进行Morris水迷宫定位航行检测，以假手术组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，计算每只大鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该值>20%判定为VD鼠。

1.6分组与给药 将40只大鼠随机分为假手术组、模型组、涤痰汤低剂量组、涤痰汤高剂量组，造模成功1 w后开始灌胃，给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定。涤痰汤高、低剂量组给药量为涤痰汤折合生药量9.71 g/kg、4.85 g/kg，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续4 w。

1.7观察指标与方法

1.7.1Morris水迷宫测试 Morris水迷宫：圆形水池，周围避光，水温保持在24℃左右，水深约30 cm，将水池均分为4个象限，任选一象限在其中央放置一个直径10 cm的圆形平台，低于水面2 cm，通过安装在水迷宫上方的摄像机追踪大鼠位置，采集的图像及视频及时传入实验配套计算机并通过水迷宫分析系统进行数据分析。检测时间为5 d，前4 d为定位航行测试，第5天为空间搜索实验。定位航行测试：将各组大鼠按照1～4四个象限的顺序放入水中，记录120 s内大鼠从入水到找到平台后四肢爬上平台并停留超过20 s所需的时间(即逃避潜伏期)，如果大鼠在120 s内找到平台，并停留超过20 s，记录120 s中实际逃避潜伏期；如果在120 s内未找到平台，由实验者将大鼠引上平台并停留5 s，逃避潜伏期记录为120 s。每天4次，连续4 d，取平均值。空间搜索实验：第5天，将平台撤除，将大鼠由任意象限放入水中，记录大鼠在120 s内跨越原平台的次数及停留时间。

1.7.2海马组织形态学观察 Morris水迷宫结束后当天断头处死大鼠，冰上迅速取脑组织，留取包含完整海马的脑段，迅速置于4%多聚甲醛(4℃，pH7.4)中固定24 h，将固定好的组织经过梯度酒精脱水，二甲苯透明后，用石蜡包埋，制作成厚度约4 μm的切片，再经过脱蜡、梯度酒精脱水、HE染色后观察海马组织学改变。

1.7.3免疫组化法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)2蛋白表达 将上述各组石蜡切片用SP法进行免疫组织化学染色，其方法严格按照试剂盒说明进行。组织中棕黄色或棕褐色颗粒为目标蛋白。在光学显微镜下，每张片子随机选取 5 个视野，采用 Leica Qwin 图像分析系统分析目标蛋白NOX2的表达情况。

1.7.4Western印迹法检测海马组织中血红素氧合酶(HO)-1蛋白表达 每组称取100 mg海马组织，尽量剪碎，置于匀浆器中，加入1 ml RIPA冰上彻底匀浆，转移离心管振荡，冰浴30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清，二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜后，室温下将膜于脱色摇床上用5%的脱脂牛奶，封闭2 h。封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜。次日，在室温下脱色摇床上用TBST洗膜3次，每次5 min。之后加入1∶3 000稀释二抗，室温下孵育30 min后，用TBST洗膜3次，每次5 min。电化学发光(ECL)显影、定影及曝光后，Alpha软件处理系统对目标带经行分析。

1.7.5海马组织ROS、GSH含量检测 准确称取海马组织1 g，按1∶9(海马组织重量：生理盐水体积=1∶9)的比例加入9倍体积的冰生理盐水，充分研磨制备海马组织匀浆。4℃，2 500 r/min离心10 min，吸取上清液，即为海马组织匀浆。严格按照试剂盒操作说明测定ROS、GSH含量。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠空间学习记忆能力的比较

2.1.1定位航行实验结果 模型组与假手术组比较，逃避潜伏期明显延长〔(39.21±4.52)vs(23.40±4.07)s，P<0.01〕；与模型组比较，涤痰汤高剂量组〔(27.33±4.15)s〕、涤痰汤低剂量组〔(33.32±5.32)s〕，逃避潜伏期明显缩短(P<0.01，P<0.05)。

2.1.2空间探索实验结果 模型组与假手术组比较，大鼠穿越原平台次数及停留时间明显减少(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤高、低剂量组大鼠穿越原平台次数及停留时间明显增加(P<0.01，P<0.05)。与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组穿越原平台次数及停留时间明显增加(P<0.05)。见表1。

2.2海马组织病理学观察 假手术组海马区神经元数量正常，形态饱满，染色均匀，细胞边界分明，细胞膜、核膜清楚，细胞核呈类圆形。模型组海马区神经元数量减少，可见坏死的神经元，细胞形态不规则，染色不均匀，细胞边界模糊，细胞膜、核膜不清晰，细胞核固缩。与模型组对比，涤痰汤高剂量组、低剂量组神经元数量增多，细胞形态较规则，染色较均匀，细胞边界较清晰。见图1。

表1 各组空间探索实验结果比较

与假手术组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01，3)P<0.05；与中药高剂量组比较:4)P<0.05；下表同

图1 各组海马神经元形态结构(HE，×400)

2.3各组NOX2表达比较 与假手术组比较，模型组NOX2蛋白相对表达量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤高剂量组、涤痰汤低剂量组NOX2蛋白相对表达量显著降低(P<0.01，P<0.05)；与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组NOX2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。见表2、图2。

2.4各组HO-1蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组HO-1蛋白相对表达量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤高剂量组、涤痰汤低剂量组HO-1蛋白相对表达量显著增高(P<0.01，P<0.05)；与涤痰汤低剂量组比较，涤痰汤高剂量组HO-1蛋白相对表达量显著增高(P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组海马 NOX2表达灰度及HO-1蛋白表达比较

图2 各组海马NOX2蛋白表达比较(DAB，×400)

图3 各组海马HO-1蛋白的表达

2.5各组ROS、GSH含量比较 与假手术组比较，模型组海马组织匀浆ROS含量明显升高(P<0.01)，GSH含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，涤痰汤高剂量组、涤痰汤低剂量组ROS含量明显降低(P<0.01，P<0.05)，GSH含量明显升高(P<0.01，P<0.01)；与涤痰汤高剂量组比较，涤痰汤低剂量组ROS含量明显升高(P<0.05)，GSH含量明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组海马组织匀浆ROS、GSH含量比较

3 讨 论

VD属于中医学“愚痴病”、“呆病”等疾病范畴，病位在脑，涉及五脏。痰浊当为VD发生认知障碍的病机中心环节，清代陈士铎在《石室秘录》中说：“痰势最盛，呆气最深”，指出痰浊盛则痴呆重。现代学者通过认知功能评价量表对血管性认知障碍患者认知功能与中医证候的相关性进行研究发现痰浊与认知障碍关系密切〔2～4〕。祛痰开窍是改善VD认知障碍的有效方法。而作为临床上治疗痴呆的经典名方涤痰汤，出自明代方贤所著的《奇效良方》，由制南星、姜半夏、炒枳实、茯苓、橘红、石菖蒲、人参、竹茹、甘草、生姜等药物组成，具有涤痰开窍、醒神定志的功效，使痰浊得化，脑窍得通，使呆病得治，可有效改善VD患者的认知功能〔5，6〕。现代研究表明，石菖蒲挥发油通过提高脑组织超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量，对抗脂质氧化及自由基的损伤作用，保护脑组织，从而改善痴呆大鼠的学习记忆能力〔7〕。人参皂甙Rb1可能通过降低海马氧化应激水平及减轻海马神经元的凋亡改善VD大鼠认知功能障碍〔8〕。

慢性脑缺血缺氧是VD的重要病理学基础，缺血缺氧可引起脑组织氧化应激反应，损伤大脑神经元导致认知功能下降〔9，10〕。NOX2与神经元的发育、活化、增殖、凋亡等过程密切相关。当NOX2过度激活，产生的过多ROS可能损伤自身或邻近的神经细胞〔11，12〕。抑制NOX2的激活，减少ROS产生，可改善小鼠空间学习记忆能力〔9，13〕。

HO-1是机体重要的抗氧化应激酶之一，受核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件通路调节，在海马神经元中高表达〔14〕。当大脑处于氧化应激状态下，HO-1裂解血红素产生Fe2+、胆绿素、一氧化碳，胆绿素进一步转化为胆红素，这些代谢产物可发挥稳定细胞膜、抗氧化等作用，从而保护神经元〔15〕。通过上调HO-1的表达能改善氧化损伤从而发挥其神经保护作用〔16〕。GSH是广泛存在于机体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂之一，在GSH过氧化物酶的催化作用下，GSH与有毒的过氧化物发生还原反应，减轻过氧化物对细胞膜的损伤。

本研究结果提示，涤痰汤可能通过调节VD大鼠海马组织的氧化应激失衡，从而改善大鼠认知功能障碍。其机制可能与涤痰汤降低NOX2、ROS的表达，提高HO-1、GSH的表达，恢复氧化应激平衡有关。由于VD的发病机制复杂，涤痰汤治疗VD的详细机制有待深入研究。