结肠癌组织中WWP1、C-myc的表达及临床意义*

孙光源，武亮，张月，薛军，史玉洁，李文贤

（河北北方学院附属第一医院 1.普外科，2.手术室，3.乳腺外科，河北 张家口 075000；张家口市第一医院 4.药剂科，5.内分泌科，河北 张家口 075100）

结肠癌发病率居恶性肿瘤第3 位[1]。近年来我国结肠癌发病率有逐年升高的趋势[2]。刘清安等[3]报道指出,我国结肠癌患者5年生存率约为32%，因此深入探讨结肠癌进展的影响因素十分重要。WWP1 蛋白主要定位于细胞浆，在乳腺癌[4]、前列腺癌[5]等恶性肿瘤中起促癌作用。而癌基因C-myc表达C-myc 蛋白主要定位于细胞核，也可见于细胞质，可调控癌基因p53家族的表达，加速乳腺癌的进展[6]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月—2017年12月河北北方学院附属第一医院收治的135 例结肠癌患者的石蜡标本。所选标本由结肠癌根治术术中获取，结肠癌标本取自肿瘤组织中央非坏死区域，癌旁正常组织标本取自距离肿瘤组织＞5 cm 非肿瘤组织。其中，男性71 例，女性64 例；年龄＜55 岁42 例，≥55 岁93 例；肿瘤位于右半结肠58 例，左半结肠77 例；肿瘤直径＜5 cm 96 例，≥5 cm 39 例；肿瘤分化程度：高分化者11 例，中分化者61 例，低分化者63 例；Dukes 分期：A 期51 例，B 期14 例，C 期70 例，未纳入D 期患者；浸润深度：T1、T2者84 例，T3、T4者51 例；无淋巴结转移65 例，有淋巴结转移70 例。纳入标准：①经病理科确诊为原发性结肠癌；②患者病历、随访资料完整，组织蜡块标本保存完好；③未合并其他恶性肿瘤；④未 合并其他影响免疫组织化学结果的严重疾病。排除标准：①临床病历资料、组织蜡块标本缺失及污损，出院后失访；②手术时年龄≥70 岁；③外科手术前已接受其他抗肿瘤手段治疗；④其他生化指标异常。本研究通过本院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。

1.2 免疫组织化学法

1.2.1 主要试剂 即用型二抗SP 试剂盒（上海优予生物科技有限公司），WWP1、C-myc 免疫组织化学法所用一抗分别为鼠抗人WWP1 单克隆抗体、鼠抗人C-myc 蛋白单克隆抗体（美国Novus 生物有限公司），二抗为生物素化兔抗鼠IgG（美国Boster 公司），辣根酶标记的链霉素卵蛋白素（上海优予生物科技有限公司）。

1.2.2 实验步骤及结果判定 将石蜡标本以4μm 为间隔进行连续切片，常规脱蜡水化，滴加3%过氧化氢H2O2室温孵育20 min，加入乙二胺四乙酸抗原修复液后，微波修复20 min。待切片自然冷却，加入一抗，4℃孵育过夜。待切片恢复至室温，滴加二抗工作液，37℃孵育10 min。滴加辣根酶标记的链霉素卵蛋白素，37℃孵育10 min。二氨基联苯胺法显色，苏木精复染。常规脱水、制片及封胶。本研究阴性对照均采用磷酸缓冲盐溶液替代一抗。染色结果由2 位病理科医师独立判断，取组织切片于200 倍光镜下，取5 个不同视野，每个视野含≥100 个细胞，最终结果取各视野评分的算术平均数。将结果分为染色评分与计数评分。①染色评分：无染色计0 分，浅黄色至黄色计1 分，黄棕色计2 分，红棕色至褐色计3 分；②计数评分：染色细胞＜6%计0 分，6%～33%计1 分，34%～66%计2 分，＞66%计3 分。将染色评分×计数评分作为总分，总分＜2 分为表达阴性，≥2 分为阳性。

1.3 随访

以患者出院为观察起点，利用电话等电子通讯手段，结合患者复诊病历，对患者及家属进行随访。对纳入患者生存情况、治疗情况及死亡原因等各种出院后的情况进行登记，所有患者登记无进展生存期（progress free survival,PFS）与总生存期（overall survival,OS）。随访截止于2018年7月31日，随访时长7～65 个月，平均（32.39±14.50）个月，中位随访时长30 个月。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制PFS 和OS 比率，比较用Log-rank χ2检验；影响因素分析用多因素Cox 回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠组织中WWP1、C-myc 的表达

免疫组织化学染色结果显示，结肠癌组织WWP1蛋白阳性表达率为74.81%，癌旁正常组织WWP1 蛋白阳性表达率为21.48%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=76.905，P=0.000）；结肠癌组织WWP1 蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织。结肠癌组织C-myc蛋白阳性表达率为67.41%，癌旁正常组织C-myc 蛋白阳性表达率为8.89%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=97.963，P=0.000）；结肠癌组织C-myc 蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织。见图1。

图1 结肠组织中WWP1、C-myc 蛋白的表达 （免疫组织化学×200）

2.2 不同影响因素的结肠癌组织中WWP1、C-myc 蛋白阳性表达率的比较

结肠癌组织WWP1、C-myc 蛋白表达受患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径及肿瘤分化程度的影响较小（P＞0.05），而受肿瘤Dukes 分期、浸润深度及淋巴结转移的影响较大（P＜0.05）。见表1。

表1 不同影响因素的结肠癌组织中WWP1、C-myc 蛋白阳性表达率的比较

续表1

2.3 结肠癌组织WWP1、C-myc 表达对患者预后的影响

2.3.1 结肠癌组织WWP1 表达对患者PFS 的影响 结肠癌组织中，WWP1 阴性表达组随访期间PFS 比率为61.76%，平均PFS（46.07±3.99）个月；而WWP1阳性表达组随访期间PFS 比率为27.72%，平均PFS（28.53±1.98）个月。两组比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=12.749，P=0.000），WWP1阴性表达组PFS 比率较高。见图2。

2.3.2 结肠癌组织C-myc 表达对患者PFS 的影响 结肠癌组织中，C-myc 阴性表达组随访期间PFS 比率为56.82%，平均PFS（42.86±3.57）个月；而C-myc阳性表达组随访期间PFS 比率为26.37%，平均PFS（28.43±2.10）个月。两组比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=11.889，P=0.001），C-myc 阴性表达组PFS 比率较高。见图2。

2.3.3 结肠癌组织WWP1 表达对患者OS 的影响 结肠癌组织中，WWP1 阴性表达组随访期间OS 比率为76.47%，平均OS（54.72±3.02）个月；而WWP1阳性表达组随访期间OS 比率为47.52%，平均OS（39.55±2.22）个月。两组比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.605，P=0.003）；WWP1 阴性表达组OS 比率较高。见图3。

2.3.4 结肠癌组织C-myc 表达对患者OS 的影响 结肠癌组织中，C-myc 阴性表达组随访期间OS 比率为72.73%，平均OS（51.78±3.10）个月；而C-myc阳性表达组随访期间OS 比率为46.15%，平均OS（39.68±2.30）个月。两组比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.456，P=0.004）；C-myc 阴性表达组OS 比率较高。见图3。

图2 结肠癌组织中WWP1、C-myc 表达对患者PFS 的影响

图3 结肠癌组织中WWP1、C-myc 表达对患者OS 的影响

2.4 Cox 回归分析结肠癌患者预后的危险因素

建立Cox 回归分析模型，以结肠癌患者预后作为应变量，列示的各指标变量作为自变量（见表1），以全子集回归方式将其纳入回归。结果显示，影响结肠癌患者预后的独立危险因素有分化程度、肿瘤Dukes 分期、浸润深度、淋巴结转移、WWP1 表达及C-myc 表达（P＜0.05）。见表2。

表2 Cox 回归分析结肠癌患者预后危险因素的相关参数

3 讨论

结肠癌早期临床症状隐匿，≥50%结肠癌患者初次就诊时已出现淋巴结转移，造成预后差[7]。早期诊断、合理治疗是提高结肠癌患者预后的研究方向。

许多研究将泛素连接酶作为寻找恶性肿瘤治疗靶点的研究重点[8-10]。WWP1 属于E3 泛素连接酶，可调控转化生长因子-β（TGF-β）[11]、10 号染色体同源丢失性磷酸张力蛋白基因[12]相关的信号通路，下调蠕虫果蝇母抗同源蛋白（Smad）[13]，调节锌指蛋白转录因子5[14]，发挥促癌基因样作用。体外研究结果表明，WWP1 能泛素化Smad4 蛋白和TGF-β 受体[15]。本研究结果可推断，WWP1 对于结肠癌细胞的侵袭过程有促进作用。

C-myc基因编码蛋白质是一种短半衰蛋白，对机体的细胞周期、细胞凋亡等具有调控作用。病理状态下，C-myc 可调控癌基因p53家族的表达，促进乳腺癌的进展[16]；同时在肺癌[17]及骨肉瘤[18]等恶性肿瘤中也呈高表达，具有一定的诊断价值。本研究结果表明，C-myc 在结肠癌组织中同样出现促癌基因样作用，可作为结肠癌诊断相关的肿瘤标志物。但关于乳腺癌的研究显示，C-myc基因与乳腺癌的分化程度、病理分型相关[16]。而本研究结果中C-myc 的表达却与结肠癌的分化程度无关，这可能由于乳腺癌同时受性激素受体调节，C-myc 与雌激素受体存在相互作用，而结肠癌受性激素影响较小。由本研究结果可推测，C-myc 在结肠癌中的作用位点近似于骨肉瘤中，即与TGF-β 受体相关[18]，但需要进一步的实验验证。

C-myc基因表达产物的主要降解途径是泛素连接酶系统[19-21]。而WWP1 属于E3 泛素连接酶。本研究结果可推测，WWP1 在结肠癌中的作用机制可能是泛素化降解C-myc 蛋白。然而WWP1 作用位点众多，C-myc 可能仅是其中一个通路，其他的路径仍然有待后续研究探明。

随访结果显示，由于WWP1、C-myc 能促进癌细胞侵袭、转移，因此其阳性表达的结肠癌组织恶性程度较高，易出现转移、复发。所以监测结肠癌组织中WWP1、C-myc 表达不仅对结肠癌的诊断具有参考价值，而且可作为对患者预后评估的参考。

综上所述，结肠癌组织中WWP1、C-myc 表达均异常高表达，且与结肠癌的侵袭、迁移密切相关。结肠癌组织中WWP1、C-myc 阳性表达患者的预后较差，且WWP1、C-myc 高表达是影响结肠癌患者术后生存期的危险因素。因此推断WWP1、C-myc 可能共同参与结肠癌的发生、进展，可作为结肠癌患者预后的参考指标。